Des aptamères pour améliorer l’encapsulation et la libération contrôlée des liposomes

Mémoire par article

Caractérisation des structures de septines hautement organisées chez la drosophile et leur interaction avec le cytosquelette d’actine

Les septines sont des GTPases conservées dérégulées dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Elles servent de protéines d’échafaudage et forment une barrière de diffusion à la membrane plasmique et au corps central lors de la cytokinèse. Elles interagissent avec l’actine et s’organisent en complexes qui polymérisent et forment des structures hautement organisées (anneaux et filaments). Leur dynamique d’assemblage et leur rôle dans la cellule restent à être élucidés. La Drosophile est un modèle simple pour l’étude des septines puisqu’on n’y retrouve que 5 gènes (sep1, sep2, sep4, sep5, peanut) comparativement aux 13 gènes chez l’humain. À l’aide d’un anticorps contre Pnut, nous avons identifié des structures tubulaires dans 30% des cellules S2 de Drosophile. Mon projet a comme but de caractériser ces tubes en élucidant leurs constituants, leur comportement et leurs propriétés pour mieux clarifier le mécanisme par lequel les septines forment des structures hautement organisées et interagissent avec le cytosquelette d’actine. Par immunofluorescence, j’ai pu démontrer que ces tubes sont cytoplasmiques, en mitose ou interphase, ce qui suggère qu’ils ne sont pas régulés par le cycle cellulaire. Pour investiguer la composition et les propriétés dynamiques de ces tubes, j’ai généré une lignée cellulaire exprimant Sep2-GFP qui se localise aux tubes et des ARNi contre les cinq septines. Trois septines sont importantes pour la formation de ces tubes et anneaux notamment Sep1, Sep2 et Pnut. La déplétion de Sep1 cause la dispersion du signal GFP en flocons, tandis que la déplétion de Sep2 ou de Pnut mène à la dispersion du signal GFP uniformément dans la cellule. Des expériences de FRAP sur la lignée Sep2-GFP révèlent un signal de retour très lent, ce qui indique que ces structures sont très stables. J’ai aussi démontré une relation entre l’actine et les septines. Le traitement avec la Latrunculin A (un inhibiteur de la polymérisation de l’actine) ou la Jasplakinolide (un stabilisateur des filaments d’actine) mène à la dépolymérisation rapide (< 30 min) des tubes en anneaux flottants dans le cytoplasme, même si ces tubes ne sont pas reconnus suite à un marquage de la F-actine. L’Actin05C-mCherry se localise aux tubes, tandis que le mutant déficient de la polymérisation, Actin05C-R62D-mCherry perd cette localisation. On observe aussi que la déplétion de la Cofiline et de l’AIP1 (ce qui déstabilise l’actine) mène au même phénotype que le traitement avec la Latrunculine A ou la Jasplakinolide. Alors on peut conclure qu’un cytosquelette d’actine dynamique est nécessaire pour la formation et le maintien des tubes de septines. Les futures études auront comme but de mieux comprendre l’organisation des septines en structures hautement organisées et leur relation avec l’actine. Ceci sera utile pour l’élaboration du réseau d’interactions des septines qui pourra servir à expliquer leur dérégulation dans le cancer et les maladies neurodégénératives.

Étude de propriétés physico-chimiques des membranes lipidiques chargées d’acide palmitique/stérol et de stéarylamine/cholestérol

Les stérosomes, des vésicules artificielles composées d’amphiphiles monoalkylés et d’un grand pourcentage de stérols, sont prometteurs dans plusieurs domaines comme les industries pharmaceutiques et alimentaires. Il existe des stérosomes chargés négativement, positivement et neutres. Dans ce mémoire, nous avons approfondi nos connaissances sur les propriétés physico-chimiques des stérosomes chargés : acide palmitique (PA)/stérol et stéarylamine (SA)/cholestérol (Chol). Premièrement, afin de mesurer la diffusion latérale de PA dans les membranes PA/stérol (30/70 mol/mol) par RMN à gradients pulsés, nous avons tenté de former des bicouches liquide-ordonnées (lo) orientées magnétiquement avec ce mélange. En s'inspirant de l’idée que l’ajout de 1,2-dihexanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DHPC), un lipide à courtes chaînes, dans le système 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) mène à la formation de bicouches orientées, nous avons étudié la formulation PA perdeutéré/acide hexanoïque (HA)/Chol avec une proportion molaire de 25/18/57 à plusieurs températures; aucune formation de bicouches orientées n’a été observée. Ce résultat pourrait être expliqué par la solubilisation partielle de HA en milieu aqueux. Alors, une quantité insuffisante serait insérée dans la bicouche pour induire son orientation. La formulation PA perdeutéré/DHPC/Chol n’a pas conduit, elle non plus, à des bicouches orientées magnétiquement à des températures et concentrations lipidiques variées. En étudiant le mélange DMPC/DHPC/Chol (67/17/14), nous avons remarqué que la présence de Chol inhibait l'orientation magnétique des bicouches. Tandis que le mélange DMPC/DHPC/stigmastérol (SS) avec les proportions molaires 67/19/14 et 72/21/7 conduisait à des bicouches orientées avec leur normale (n) perpendiculaire au champ magnétique à 40 °C et 50 °C. Ces résultats suggèrent que le mélange PA/SS avec une proportion de lipide à courtes chaînes, HA et DHPC, pourrait mener à des bicouches orientées magnétiquement. Le mélange PA/Chol avec un lipide à courtes chaînes pourrait aussi être étudié en présence des lanthanides. Deuxièmement, nous avons examiné la possibilité de moduler la libération de matériel encapsulé dans des liposomes essentiellement composés de PA et d’un stérol. Il est connu que le mélange PA/Chol (30/70) à pH ≥ 7,5 forme des liposomes très peu perméables. Il est avantageux de pouvoir moduler la perméabilité pour avoir un contrôle sur le temps de libération de leur contenu, qui est un paramètre de grande importance pour les formulations liposomales de médicaments. D’abord, il a été montré que l’acide oléique (OA)/Chol (30/70) est capable de former des vésicules, ce qui n’avait jamais été prouvé auparavant. Par contre, les bicouches OA/Chol (30/70) ne sont pas plus perméables que les bicouches PA/Chol (30/70). L’ajout de 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine (POPC) dans le mélange PA/Chol n’augmente pas plus la perméabilité. En effet, les cinétiques de relargage de calcéine des vésicules PA/POPC/Chol (15/27.5/57.5), POPC/Chol (40/60) et POPC étaient très semblables à celle de PA/Chol (30/70). Il a été remarqué que les études littéraires se contredisent à propos de la perméabilité à la calcéine des bicouches de phosphatidylcholine (PC). L’explication de ces divergences est inconnue pour le moment. En remplaçant la moitié de la proportion molaire de Chol par le cholate de sodium (SC) dans le mélange PA/Chol (30/70), la membrane n’était pas plus apte à libérer son contenu. Il se pourrait que le SC se retrouvant dans la bicouche n’induit pas une diminution d’empilement. Il est aussi possible que le SC ne s'insère pas dans la membrane à cause de son hydrophilie considérable et il pourrait alors former seul des micelles. En remplaçant complètement le Chol par le sulfate de cholestérol (SChol), un stérol chargé négativement, et en préparant les vésicules à un bas pH, la formulation PA/SChol (30/70) mène à une très grande perméabilité à pH 7.5; le relargage est provoqué par un saut de pH. Nos travaux suggèrent qu'il serait possible de moduler la perméabilité des liposomes en les préparant avec le mélange PA/SChol/Chol en variant les proportions entre 30/63/7 à 30/70/0. Le diagramme pH-composition du mélange PA/SChol/Chol indique que ces proportions conduisent, à pH 7.4, à la coexistence de phases solide et lo en différentes proportions, ce qui pourrait moduler la perméabilité membranaire. Troisièmement, les résultats de perméabilité obtenus avec la calcéine et les difficultés survenues lors de l’extrusion des vésicules encapsulant cette sonde nous ont amené à nous demander si la calcéine interagit avec les bicouches chargées. L’impact de certains anions, dont la calcéine, a été examiné sur les bicouches chargées positivement SA/Chol (50/50). La calorimétrie différentielle à balayage (DSC, de l’anglais differential scanning calorimetry), indique qu’il n’y a aucune transition entre 25 et 90 °C pour les liposomes SA/Chol (50/50) à pH = 7.4. L’ajout de chlorure de sodim (375 mM) n’a pas mené à la formation d’agrégats et aucune transition n’a été observée sur le thermogramme. La formation d’agrégats macroscopiques instantanément après l’ajout d’hydrogénophosphate de sodium (125 mM), de sulfate de sodium (125 mM) et de calcéine (3 mM) a été observée. Une transition a été observée sur les thermogrammes en présence de ces sels. Les agrégats observés pourraient être associés à la transition de phase. L’effet des anions sur la température et l’enthalpie de transition suivent le même ordre que la série d’Hofmeister : sulfate > hydrogénophosphate > chlorure (pas de pic). La calcéine avait l’impact le plus prononcé sur l’agrégation; ceci illustre que la calcéine n’est pas une sonde fluorescente inerte avec le mélange SA/Chol. Elle pourrait être un chaotrope volumineux. De plus, les interactions SA-calcéine plus fortes, menant à l’agrégation des vésicules, que les interactions PC-calcéine pourraient s’expliquer par le fait que la SA est chargée positivement.

L’exploitation d’un modèle de levure présentant une déficience de l’absorption des anthracyclines révèle qu’une protéine de Caenorhabditis elegans, OCT-1, est un transporteur fonctionnel d’anthracyclines

Les anthracyclines, comme la doxorubicine (DOX) ou la daunorubicine (DNR), sont utilisées dans le traitement d’une grande variété de cancers allant des lymphomes, au cancer du sein, en passant par certaines leucémies. Encore aujourd’hui, beaucoup pensent que les anthracyclines entrent dans les cellules par diffusion passive, toutefois, la plupart de ces mêmes personnes sont d’accord pour dire que la p-glycoprotéine est responsable d’exporter ces molécules hors de la cellule. Mais pourquoi une molécule aurait besoin d’un transporteur pour sortir de la cellule, et pas pour y entrer ? Qu’est-ce qui ferait que la diffusion passive fonctionnerait dans un sens, mais pas dans l’autre, d’autant que l’entrée des anthracyclines dans les cellules est très rapide ? Nous pensons qu’il existe bel et bien un transporteur responsable de faire passer les anthracyclines du milieu extracellulaire au cytoplasme, et nous voulons développer un modèle de levure qui permettrait de déterminer si une protéine, un transporteur, issue d’un autre organisme eucaryote est en mesure de transporter la DOX à l’intérieur de la cellule. Pour ce faire, nous avons rassemblé un groupe de mutants présentant une déficience dans l’absorption d’autres molécules chargées positivement telles que la bléomycine ou le NaD1 et avons déterminé le taux d’absorption de DOX de chacun de ces mutants. Les simples mutants sam3Δ ou dur3Δ n’ont montré qu’une faible réduction de l’absorption de DOX, voire, aucune, par rapport à la souche parentale. Si le double mutant sam3Δdur3Δ a montré une réduction relativement importante de l’absorption de DOX, c’est le mutant agp2Δ qui présentait la plus grande réduction d’absorption de DOX, ainsi qu’une résistance notable à son effet létal. Nous avons utilisé, par la suite, ce mutant pour exprimer, à l’aide d’un vecteur d’expression, une protéine du ver Caenorhabditis elegans, OCT-1 (CeOCT-1). Les résultats ont montré que cette protéine était en mesure de restaurer l’absorption de DOX, compromise chez le mutant agp2Δ ainsi que d’augmenter la sensibilité de la souche parentale à son effet létal, lorsqu’exprimée chez celle-ci. Cela suggère que CeOCT-1 est un transporteur fonctionnel de DOX et contredit également le dogme selon lequel les anthracyclines entrent dans les cellules par diffusion passive.