Papel del inmunogen isg15 de lubina (Dicentrarchus labrax) en las infecciones por betanodavirus

En peces, al igual que en vertebrados superiores, la respuesta antiviral innata est�� mediada por el sistema interfer��n tipo I (IFN I), que act��a mediante la activaci��n de genes denominados isg (interferon-stimulated genes), entre los que se incluye el gen isg15. La prote��na codificada por este gen, denominada ISG15, presenta actividad antiviral actuando como citoquina, o mediante un mecanismo denominado ISGilaci��n, que consiste en su uni��n covalente a proteínas v��ricas o celulares. Entre las enfermedades de etiolog��a viral que afectan a la lubina (Dicentrarchus labrax), destaca la necrosis nerviosa viral, causada por el virus de la necrosis nerviosa (NNV, g��nero Betanodavirus), que presenta dos segmentos de ARN monocatenario de polaridad positiva: ARN1 (polimerasa viral) y ARN2 (prote��na de la c��pside). Las diferencias en la secuencia de la regi��n variable T4 del segmento ARN2 permiten su clasificaci��n en 4 genotipos, siendo el genotipo RGNNV el ��nico asociado a episodios de elevada mortalidad en lubina. El presente estudio contribuye a ampliar el conocimiento del papel del sistema IFN I en lubina frente a infecciones por betanodavirus, describi��ndose la estructura del gen isg15, analizando su transcripci��n en respuesta a poli I:C y RGNNV; y evaluando su actividad in vitro. La lubina presenta un gen isg15, compuesto por dos exones y un intr��n localizado en la regi��n 5���-UTR. El ORF, de 474 pb, codifica una prote��na de 157 amino��cidos constituida por dos dominios tipo ubiquitina y un motivo RLRGG en el extremo carboxilo terminal. La clonaci��n del ORF en el pl��smido pcDNA His/Max, y su posterior transfecci��n en la l��nea celular E-11, ha permitido obtener una l��nea celular estable (DLISG15-E11), en la que se ha demostrado, mediante inmunofluorescencia indirecta, la localizaci��n citoplasm��tica de esta prote��na. El an��lisis de transcripci��n muestra una respuesta m��s temprana e intensa tras la inducci��n por poli I:C que por RGNNV. Poli I:C estimula la expresi��n g��nica desde las 4 hasta las 24 h post-inyecci��n (p.i.) en ambos ��rganos, y con una cin��tica similar. Sin embargo, ambos ��rganos difieren en el nivel de transcripci��n del gen tras la infecci��n por RGNNV, produci��ndose una estimulaci��n temprana, desde las 12 h p.i., y de mayor nivel en el cerebro que en el ri����n cef��lico, ��rgano en el que la expresi��n comienza a las 72 h p.i. La actividad antiviral se ha evaluado mediante el an��lisis comparativo de la replicaci��n de RGNNV, determinada mediante PCR cuantitativa, en c��lulas DLISG15-E11 y c��lulas control no transfectadas, no observ��ndose diferencias significativas. Sin embargo, ISG15 podr��a actuar a otro nivel del ciclo de multiplicaci��n viral, por lo que se est��n realizando ensayos de rendimiento v��rico extracelular mediante titulaci��n, y de ISGilaci��n mediante Western-blot. El hecho de que el cerebro sea el principal ��rgano diana para la multiplicaci��n de betanodavirus, y el papel antiviral atribuido a la ISG15, junto con los resultados obtenidos, contribuyen a dilucidar la importancia de este gen frente a las infecciones por RGNNV en lubina, increment��ndose el conocimiento del papel del sistema del IFN I en la defensa frente a las infecciones v��rcas y la relaci��n pat��geno-hospedador.

Caracterizaci��n funcional de las proteínas TasA y TapA en la formaci��n de fibras de tipo amiloide en Bacillus subtilis

Las proteínas amiloides son un grupo heterog��neo de proteínas diferentes en secuencia aminoac��dica, pero similares en su estructura cuaternaria: fibras enriquecidas en l��minas beta, con gran estabilidad, resistencia y capacidad de uni��n de colorantes espec��ficos, como el rojo congo o la thioflavina T. Estas proteínas han estado tradicionalmente asociadas a patolog��as neurodegenerativas en humanos como el Alzheimer o el Parkinson. Sin embargo, los miembros dentro de esta familia est��n ampliamente distribuidas en la naturaleza, desde bacterias hasta humanos, e intervienen en un amplio rango de funciones biol��gicas, motivo por el que se han denominado ���amiloides funcionales���. En bacterias, los amiloides funcionales son responsables de participar en funciones muy diversas como la interacci��n c��lula-c��lula, con superficies abi��ticas, y formaci��n de biofilms. En Bacillus subtilis, la prote��na amiloide TasA es el componente proteico mayoritario de la matriz extracelular del biofilm de este microorganismo y el principal elemento que constituye las fibras amiloides, mientras que la prote��na auxiliar TapA, presente en mucha menor proporci��n, act��a favoreciendo el ensamblaje de las mismas. Estas act��an como un andamiaje proteico donde se disponen el resto de componentes de la matriz extracelular, lo que confiere a esta estructura una mayor estabilidad y, por consiguiente, proporcionan una mayor robustez al biofilm. En este este trabajo se pretende llevar a cabo el an��lisis de regiones o dominios tanto de TasA como de TapA importantes para la amiloidog��nesis, as�� como para la funcionalidad de ambas proteínas. Para ello, el estudio se ha enfocado desde un punto de vista multidisciplinar, combinando pruebas cl��sicas de caracterizaci��n de amiloides con t��cnicas de biolog��a molecular y diversas pruebas biof��sicas. Los resultados obtenidos hasta la fecha han demostrado la existencia de peque��as secuencias, dentro de las proteínas TasA o TapA con capacidad para polimerizar en la forma de fibras, lo que muestra su importancia en el proceso de fibrilaci��n y en la funcionalidad de ambas proteínas. En el caso de la prote��na TapA, las regiones analizadas ponen de manifiesto la importancia de su extremo amino-terminal tanto en la funcionalidad de la prote��na como en su interacci��n con TasA.