Selected Reaction Monitoring (SRM) frente a Western Blot

We propose the SRM technology as a complementary method to the Western Blot for the detection and quantification of proteins in a sample. The technique Western Blot has its own limitations: i) only a protein-of-choice is detected, ignoring any non-relevant proteins, ii) the sensitivity of the technique depends on the specificity of the antibody and iii) Western Blot is expensive and time-consuming. The advantages of SRM with respect Western Blot are remarkable: i) you can detect up to hundreds of different proteins in a sample, ii) SRM is more sensitive, because just 50 copies of the target protein per cell are enough for the detection and iii) once it has been made an investment in the necessary machinery to develop this technique, the detection of proteins in a sample turns into a cheaper, faster, more specific and full-quantitative procedure, without the need of using antibodies. First of all, SRM requires the identification of little peptides, obtained by tryptic digestion, whose sequence must be unique for a single protein or isoform. There is software for that aim. Then, it’s necessary to create isotope-labeled peptides of that identified for acting as internal standards. That sample is introduced in a triple quadrupole mass spectrometer: it passes through a first quadrupole, which functions as a filter, where the fragments are selected, previously ionized, attending to the mass/charge (m/z) relation that correspond to that unique fragments of the protein of interest. In this first selection may be other peptides from other proteins, with the same m/z but with different sequence. To select those that are exclusive from the target protein, the fragments are moved to a second quadrupole, where they are fragmented again with a physical method, and so new smaller fragments are generated. All the new fragments are conduced to the third quadrupole, where just those which come from the protein of interest are selected, attending at their m/z again. The target peptide concentration is determined by measuring the observed signal response for the target peptide relative to that of the isotopic-labeled peptide, the concentration of which is calculated from a pre-determined calibration-response curve. Calibration curves have to be generated for each target peptide in the sample. Because SRM technology is increasing its use, there have been developed databases where the scientific community upload information about protocols and standards for each protein with the aim to facilitate the work to other researchers.

Perfil conductual de las drogas de diseño MBDB, MDEA y PMA en modelos animales de agresión y ansiedad

MBDB, MDEA y PMA son tres drogas de diseño, estructuralmente similares al MDMA (“éxtasis”), que se han identificado en la composición de pastillas distribuidas como “éxtasis” en entornos recreativos durante los últimos treinta años. Estas feniletilaminas sintéticas presentan un perfil psicotrópico de tipo entactógeno (con capacidad para facilitar la proximidad, el contacto y la comunicación empática), similar al del MDMA en el modelo de discriminación de drogas. El MDMA ha sido objeto de un creciente interés científico y es, hasta la fecha, la única sustancia con un perfil entactógeno de la que se han investigado sus efectos conductuales en modelos animales de agresión y ansiedad, si bien sus resultados no siempre coinciden. Aunque existen algunas evidencias de que el MDMA puede tener efectos ansiolíticos en animales de laboratorio (Lin, Burden, Christie, & Johnston, 1999; Morley & McGregor, 2000; Ho, Pawlak, Guo, & Schwarting, 2004), en otros estudios se han observado alteraciones conductuales y correlatos neuroquímicos que sugieren un efecto ansiogénico (Bhattacharya, Bhattacharya & Ghosal, 1998; Gurtman, Morley, Li, Hunt, & McGregor, 2002; Maldonado & Navarro, 2000;; Navarro & Maldonado, 2002). Asimismo, en otros trabajos se ha señalado que el MDMA induce efectos antiagresivos (reducción de las conductas de amenaza y ataque), que se acompañan de un marcado aumento de las conductas de evitación/huida y defensa/sumisión, así como de una reducción de las conductas de investigación social, sugiriendo también la existencia de un perfil ansiogénico en los encuentros agonísticos entre ratones machos (Maldonado & Navarro, 2001; Navarro & Maldonado, 1999). En contraste, hasta la fecha la información experimental de las drogas MBDB, MDEA y PMA se limita a la evaluación de sus efectos conductuales sobre la conducta motora, así como algunos estudios sobre su metabolismo y posible mecanismo de acción. El objetivo general de este trabajo de investigación ha sido estudiar el perfil conductual de MBDB, MDEA y PMA en modelos animales de agresión y ansiedad. Para ello, se han examinado los efectos del MBDB (2, 4 y 8 mg/kg), MDEA (5, 10 y 20 mg/kg) y PMA (2, 4, 8 y 12 mg/kg) utilizando el modelo de agresión inducida por aislamiento y el modelo de ansiedad del laberinto elevado en cruz en ratones machos. Los resultados indican que estas sustancias en general comparten un perfil antiagresivo inespecífico. Esta falta de especificidad se debe en unos casos al aumento de las conductas de inmovilidad (4-12 mg/kg PMA), pero también a la presencia de propiedades ansiogénicas durante la interacción social, en especial con dosis elevadas, mientras que solo las dosis más bajas parecen aumentar la proximidad social, en especial la dosis menor de MBDB. Además, estas drogas parecen alterar el patrón conductual agonístico ofensivo (MBDB y MDEA) y defensivo (MBDB, MDEA y PMA), produciendo cambios diádicos que resultan coherentes con un aumento del nivel de conflicto y de ansiedad. En consonancia, los resultados del modelo del laberinto elevado en cruz indican que el MBDB produce un aumento de la ansiedad de menor intensidad que el producido por el MDMA. Sin embargo, MDEA y PMA parecen generar un estado de hipoexploración, y solo en dosis determinadas (20 mg/kg de MDEA y 4 mg/kg de PMA) muestran alteraciones discretas que sugieren un efecto ansiogénico débil, un perfil que en conjunto podría sugerir cierta similitud con alteraciones conductuales propias de los compuestos alucinógenos. Debido a la diferencia del perfil conductual del MDEA y PMA hallados en ambos modelos, sería necesario evaluar la ansiedad y su posible relación con la dosis y/o con la presencia de un oponente en la prueba en otros modelos experimentales. Lin, H. Q., Burden, P. M., Christie, M. J., & Johnston, G. A. R. (1999). The anxiogenic-like and anxiolytic-like effects of MDMA on mice in the elevated plus-maze: A comparison with amphetamine. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 62(3), 403-408. Morley, K. C., & McGregor, I. S. (2000). (±)-3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA, 'ecstasy') increases social interaction in rats. European Journal of Pharmacology, 408(1), 41-49. Bhattacharya, S. K., Bhattacharya, A., & Ghosal, S. (1998). Anxiogenic activity of methylenedioxymethamphetamine (Ecstasy): An experimental study. Biogenic Amines, 14(3), 217-237. Gurtman, C. G., Morley, K. C., Li, K. M., Hunt, G. E., & McGregor, I. S. (2002). Increased anxiety in rats after 3,4-methylenedioxymethamphetamine: Association with serotonin depletion. European Journal of Pharmacology, 446(1-3), 89-96. Ho, Y., Pawlak, C. R., Guo, L., & Schwarting, R. K. W. (2004). Acute and long-term consequences of single MDMA administration in relation to individual anxiety levels in the rat. Behavioural Brain Research, 149(2), 135-144. Maldonado, E., & Navarro, J. F. (2000). Effects of 3,4-methylenedioxy-methamphetamine (MDMA) on anxiety in mice tested in the light/dark box. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, 24(3), 463-472. Maldonado, E., & Navarro, J. F. (2001b). MDMA ('ecstasy') exhibits an anxiogenic-like activity in social encounters between male mice. Pharmacological Research, 44(1), 27-31. Navarro, J. F., & Maldonado, E. (1999). Behavioral profile of 3,4-methylenedioxy-methamphetamine (MDMA) in agonistic encounters between male mice. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, 23(2), 327-334. Navarro, J. F., & Maldonado, E. (2002). Acute and subchronic effects of MDMA ("ecstasy") on anxiety in male mice tested in the elevated plus-maze. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, 26(6), 1151-1154.