Redução dos níveis de Ocratoxina A por ação da enzima peroxidase

A ocratoxina A é um composto formado a partir do metabolismo secundário de fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. Uma vez que a presença dessa micotoxina nos alimentos causa sérios danos à saúde humana e animal, surge o interesse pelo desenvolvimento de métodos que visem a redução dos seus níveis em diferentes matrizes. Diversos processos de descontaminação têm sido propostos, sendo que os métodos de redução biológica tem recebido destaque. Esses métodos consistem na aplicação de micro-organismos ou de suas enzimas, o que gera a biotransformação ou degradação da toxina produzindo metabólitos com menor ou nenhuma toxicidade. Diante disso, o objetivo geral do trabalho foi avaliar o efeito da peroxidase na redução dos níveis de ocratoxina A. As enzimas peroxidases testadas foram a comercial e a obtida do farelo de arroz. Para a extração enzimática foram utilizadas as frações granulométricas do farelo de arroz de 48 a 100 mesh, sendo estas frações caracterizadas quimicamente. A peroxidase foi extraída do farelo de arroz em tampão 10 mM pH 5,0 e purificada por partição trifásica, obtendo 77,1% de recuperação e 9,2 para o fator de purificação. O método utilizado para a extração da ocratoxina A do sistema aquoso foi por partição líquido-líquido utilizando como solvente o clorofórmio, sendo esse método validado segundo os parâmetros de linearidade (0,1 a 20 ng mL-1), coeficientes de correlação (0,9997) e de determinação (0,9994), e limites de detecção (0,02) e quantificação (0,03). A afinidade entre as peroxidases e a ocratoxina A foi verificada segundo os parâmetros de KM e Vmáx, resultando em 0,00027 mM e 0,000015 mM min-1, respectivamente, para a peroxidase comercial, e 0,0065 mM e 0,000031 mM min-1 para a obtida do farelo de arroz. Com relação aos percentuais de redução de ocratoxina A, foram avaliadas 3 proporções enzima:substrato (1:10, 1:5 e 8:1 para a comercial e 1:10, 1:5 e a com atividade de 0,063 U mL-1 para a do farelo), sendo que as proporções que forneceram maior redução foi a de 8:1 para a enzima comercial (0,063 U mL-1) e a correspondente a 0,063 U mL-1 para a enzima obtida do farelo. Os percentuais de redução de ocratoxina A foram de 59% para a peroxidase comercial em 300 min e 41% para a peroxidase do farelo de arroz em 1440 min. O efeito de adsorção da ocratoxina A pela enzima peroxidase foi descartado uma vez que foi realizada a sua hidrólise com a enzima pepsina e verificado um percentual de 2,7% de adsorção, demonstrando que a redução foi por ação enzimática. A enzima obtida de farelo de arroz com atividade de 0,063 U mL-1 foi aplicada em suco de uva tinto e branco. Observou-se que para o primeiro não houve redução significativa, enquanto que para o segundo a redução foi de 17%. Neste trabalho, então, foi possível verificar a capacidade de redução dos níveis da ocratoxina A pela enzima peroxidase, tanto em sistema aquoso como no suco de uva integral branco.

Produção e extração da enzima anidrase carbônica e de ficobiliproteínas a partir de microalgas

Muito interesse tem sido focado no potencial biotecnológico das microalgas, principalmente devido à identificação de diversas substâncias sintetizadas por estes organismos, dentre elas a anidrase carbônica e as ficobiliproteínas. A anidrase carbônica é uma metaloenzima que catalisa a hidratação reversível do CO2 em bicarbonato com alta eficiência, sendo utilizada para captação de CO2 através de sistemas biológicos. A C-ficocianina e a aloficocianina, corantes naturais, são os dois principais componentes das ficobiliproteínas em cianobactérias e apresentam diversas aplicações dentro da indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica. O objetivo principal desta tese foi avaliar a produção e a extração da anidrase carbônica e das ficobiliproteínas a partir de diferentes microalgas. Para isso, primeiramente foi realizado uma investigação da produção da anidrase carbônica pela microalga Dunaliella tertiolecta, onde foi estudada a extração da enzima e sua aplicação em sistemas de captura enzimática de CO2. Posteriormente foi avaliada a produção da enzima ao longo do cultivo de diferentes microalgas marinhas e dulcícolas (Dunaliella tertiolecta, Tetraselmis sueccica, Phaeodactylum tricornutum, Nannochloropsis oculata, Isochysis galbana, Chlorella vulgaris e Scenedesmus obliquus). A produção da enzima e de ficobiliproteínas, também, foi estudada para as cianobactérias Spirulina platensis LEB 52, Spirulina sp. LEB 18 e Synechococcus nidulans. Todos os cultivos foram acompanhados em termos de biomassa e pH. Por último, foi realizado um estudo de extração da enzima de P. tricornutum e extração conjunta da anidrase carbônica e de ficobiliproteínas da cianobactéria S. sp. LEB 18. Os cultivos foram realizados em frascos erlenmeyer contendo os meios Conway (marinhas), BG-11 (dulcícolas) e Zarrouk 20% (cianobactérias). Na avaliação da ruptura celular foram testadas as técnicas de maceração em gral e pistilo, agitação em vórtex com pérolas de vidro, sonicação com pérolas de vidro, homogeneizador ultrassônico, secagem, congelamento e descongelamento e a combinação de tratamentos. Maiores rendimentos de extração da enzima a partir da microalga D. tertiolecta foram obtidos utilizando tratamento ultrassônico, juntamente com baixas concentrações de biomassa úmida (0,1 e 0,2 g/L), e a mesma apresentou potencial para aplicação em processos de captação enzimática do CO2. Durante os cultivos, a microalga C. vulgaris se destacou como maior produtora da enzima anidrase carbônica, atingindo valores de atividade enzimática de 44,0 U/L. As cianobactérias apresentaram valores de atividade entre 41,6 e 45,9 U/L, sendo que a S. sp. LEB 18 foi a que apresentou maiores produções de C-ficocianina e aloficocianina no ponto de máxima atividade volumétrica, 65,9 e 82,2 µg/mL, respectivamente. A enzima extraída da biomassa de S. platensis LEB 52 catalisou a hidratação do CO2 que precipitou na forma de CaCO3. Maiores rendimentos de extração da enzima a partir das microalgas P. tricornutum e S. sp. LEB 18 foram obtidos utilizando homogeneizador ultrassônico, que foram 31,3 U/g e 25,5 U/g, respectivamente. A biomassa de S. sp. LEB 18, também apresentou potencial para a extração de ficobiliproteínas, obtendo- se altas concentrações de C-ficocianina (100,5 mg/g) e aloficocianina (69,9 mg/g). Através dos resultados obtidos, pode-se verificar a potencialidade das microalgas e das cianobactérias para produção da enzima anidrase carbônica e das ficobiliproteínas, biomoléculas de alto valor industrial. Este trabalho apresenta processos eficientes para a extração da enzima e de ficobiliproteínas tanto para escala laboratorial como industrial.

Biodegradação de deoxinivalenol por aspergillus oryzae e rhizopus sp.: um estudo bioquímico de degradação e toxicidade

A contaminação aleatória de alimentos por micotoxinas afeta as condições de sanidade das dietas de humanos e animais. Dentre as toxinas fúngicas, deoxinivalenol (DON) se destaca pela freqüente contaminação de produtos agrícolas e alimentos e pela sua resistência a degradação pelo emprego de métodos tradicionais de processamento, o que motiva políticas de controle e a busca por técnicas de descontaminação. A descontaminação biológica empregando processsos fermentativos tem sido apontada como uma alternativa promissora, pois permite degradar micotoxinas através do sistema enzimático microbiano e melhorar características funcionais e sensoriais de matérias-primas e insumos alimentícios. Este trabalho teve por objetivo estudar condições e mecanismos de biodegradação de deoxinivalenol empregando Aspergillus oryzae e Rhizopus sp. em sistemas fermentativos submersos. Para tanto, foi necessário adequar metodologia para reação de derivação na determinação cromatográfica de DON; estudar o potencial e condições de degradação via fermentação submersa por Aspergillus oryzae e Rhizopus sp.; e avaliar a atividade de oxidoredutases e a citotoxicidade dos extratos fementados. A otimização da metodologia estabeleceu a melhor condição para a reação de derivação com 200 µL de anidrido trifluoroacético e 18 mg de bicarbonato de sódio, durante 6 minutos a 74 °C na faixa entre 7 e 21 µg de DON. A quantificação de DON residual no meio fermentado mostrou que as espécies fúngicas Rhizopus sp. e Aspergillus oryzae possuem a capacidade de degradar DON demonstrando índices médios de 87,4 e 62,4% respectivamente, principalmente quando o meio submerso foi água estéril e fermentação realizada durante 48 horas. A velocidade máxima de degradação neste intervalo foi de 10,8 e 12,4 ppb/h, observando também um aumento na atividade específica da enzima peroxidase. Os extratos dos fermentados com A. oryzae e Rhizopus sp. apresentaram efeito de inibição de proliferação celular (IC50) quando concentrados 10 vezes em 48 e 72 horas respectivamente. Os meios fermentados com Rhizopus sp. apresentaram menor efeito (1,5 vezes) quando comparado com Aspergillus oryzae.

Purificação, modelagem e simulação da adsorção de bioprodutos por troca iônica em coluna de leito expandido

A produção de proteínas através de microrganismos tornou-se uma técnica muito importante na obtenção de compostos de interesse da indústria farmacêutica e alimentícia. Extratos brutos nos quais as proteínas são obtidas são geralmente complexos, contendo sólidos e células em suspensão. Usualmente, para uso industrial destes compostos, é necessário obtê-los puros, para garantir a sua atuação sem interferência. Um método que vem recebendo destaque especialmente nos últimos 10 anos é o uso da cromatografia de troca iônica em leito expandido, que combina em uma única etapa os passos de clarificação, concentração e purificação da molécula alvo, reduzindo assim o tempo de operação e também os custos com equipamentos para realização de cada etapa em separado. Combinado a este fato, a última década também é marcada por trabalhos que tratam da modelagem matemática do processo de adsorção de proteínas em resinas. Está técnica, além de fornecer informações importantes sobre o processo de adsorção, também é de grande valia na otimização da etapa de adsorção, uma vez que permite que simulações sejam feitas, sem a necessidade de gasto de tempo e material com experimentos em bancada, especialmente se é desejado uma ampliação de escala. Dessa forma, o objetivo desta tese foi realizar a modelagem e simulação do processo de adsorção de bioprodutos em um caldo bruto na presença de células, usando inulinase e C-ficocianina como objeto de estudo e purificar C-ficocianina utilizando resina de troca iônica em leito expandido. A presente tese foi então dividida em quatro artigos. O primeiro artigo teve como objeto de estudo a enzima inulinase, e a otimização da etapa de adsorção desta enzima em resina de troca iônica Streamline SP, em leito expandido, foi feita através da modelagem matemática e simulação das curvas de ruptura em três diferentes graus de expansão (GE). As máximas eficiências foram observadas quando utilizadas maiores concentrações de inulinase (120 a 170 U/mL), e altura de leito entre 20 e 30 cm. O grau de expansão de 3,0 vezes foi considerado o melhor, uma vez que a produtividade foi consideravelmente superior. O segundo artigo apresenta o estudo das condições de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica, onde foi verificado o efeito do pH e temperatura na adsorção e após construída a isoterma de adsorção. A isoterma de adsorção da C-ficocianina em resina Streamline Q XL feita em pH 7,5 e a 25°C (ambiente), apresentou um bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores qm (capacidade máxima de adsorção) e Kd (constante de equilíbrio) estimados pela equação linearizada da isoterma, foram de 26,7 mg/mL e 0,067mg/mL. O terceiro artigo aborda a modelagem do processo de adsorção de extrato não clarificado de C-ficocianina em resina de troca iônica Streamline Q XL em coluna de leito expandido. Três curvas de ruptura foram feitas em diferentes graus de expansão (2,0, 2,5 e 3,0). A condição de adsorção de extrato bruto não clarificado de C-ficocianina que se mostrou mais vantajosa, por apresentar maior capacidade de adsorção, é quando se alimenta o extrato até atingir 10% de saturação da resina, em grau de expansão 2,0, com uma altura inicial de leito de 30 cm. O último artigo originado nesta tese foi sobre a purificação de C-ficocianina através da cromatografia de troca iônica em leito expandido. Uma vez que a adsorção já havia sido estudada no artigo 2, o artigo 4 enfoca na otimização das condições de eluição, visando obter um produto com máxima pureza e recuperação. A pureza é dada pela razão entre a absorbância a 620 nm pela absorbância a 280 nm, e dizse que quando C-ficocianina apresenta pureza superior a 0,7 ela pode ser usada em como corante em alimentos. A avaliação das curvas de contorno indicou que a faixa de trabalho deve ser em pH ao redor de 6,5 e volumes de eluição próximos a 150 mL. Tais condições combinadas a uma etapa de pré-eluição com 0,1M de NaCl, permitiu obter C-ficocianina com pureza de 2,9, concentração 3 mg/mL, e recuperação ao redor de 70%.

Produção de lipidios funcionais por ação de lipase fúngica

A modificação estrutural de óleos e gorduras é uma das principais áreas de interesse de pesquisa em diferentes setores industriais. No caso da indústria de alimentos, a interesterificação é empregada para melhorar propriedades nutricionais e funcionais, em que se obtêm compostos diferentes dos que lhes deram origem. As lipases microbianas são os biocatalisadores mais utilizados industrialmente, por serem mais estáveis, específicas e com propriedades bem mais diversificadas que as lipases de outras fontes. Este trabalho objetivou, primeiramente, a caracterização da gordura da pele de frango (GPF) e sua comparação com óleo de soja, como referência, visando a utilização de GPF em reações de interesterificação. Para isto foram caracterizados quanto aos índices de rancidez hidrolítica e oxidativa, bem como de matéria insaponificável, índices de saponificação, refração e iodo. Foi realizado ainda o fracionamento e perfil de ácidos graxos destes lipídios e suas frações, com o cálculo de seus índices nutricionais. Foi verificado que a GPF apresentou qualidade satisfatória devido aos baixos índices de acidez (0,65 g ácido oleico.100 g -1 ), peróxido (2,14 meq.kg-1 ), p-anisidina (0,70 unidades de absorvância.g-1 ), além de fonte de ácidos graxos mono-insaturados (40%), sendo fonte promissora para estudos de interesterificação. Em um segundo momento o objetivo foi produzir lipídios modificados ricos em ácidos graxos essenciais a partir da gordura da pele de frango e ácidos graxos ramificados, utilizando lipase sn-1,3 específica e interesterificação do tipo acidólise. Foram estudados os fatores concentração de enzima, adição de água, proporção de substratos e tempo, segundo um planejamento experimental fatorial completo 2 4 . As separações analíticas foram executadas em placas de cromatografia de camada delgada, sendo as frações posteriormente extraídas, ressuspensas e injetadas no cromatógrafo a gás. Foi verificado que a adição de água ao meio reacional apresentou efeito significativo (p<0,05) para todos ácidos graxos avaliados dos triacilgliceróis, sendo que para o ácido essencial linoleico (C18:2) o efeito do tempo de reação também foi significativo, sendo verificado que quanto maior o tempo de reação, menor a quantidade de água a ser adicionada. Em um terceiro momento, o objetivo foi produzir éster fenólico a partir do DHCA, além de realizar reações de transesterificação deste éster com tricaprilina. Para a reação de transesterificação, foi utilizado um delineamento composto central rotacional (DCCR) variando a quantidade de enzima, tempo de reação e temperatura sobre a resposta (%) dos reagentes consumidos. A lipase Novozym® 435 de Candida antarctica foi utilizada como catalisador de todas reações. Foi verificado que a maior produção de éster (50%) ocorreu em oito dias. Nas reações de transesterificação, as relações molares em que houve maior consumo do éster produzido foram 1:5 e 1:10, sendo obtidos 21,1% e 29,6% de residual de dihidrocafeato de octila, respectivamente em 24 h. Foi observado que em altas temperaturas e tempo superior a 26 h, houve o menor residual de dihidrocafeato de octila (18,2%). Foram identificados três diferentes compostos fenólicos, contendo em sua estrutura dihidrocafeato de octila e ácido caprílico.

Hidrolisados protéicos de anchoita (engraulis anchoita): obtenção, atividade antioxidante e aplicação em embutido emulsionado

Uma alternativa para pescados subaproveitados e subprodutos da industrialização de pescado é o desenvolvimento de processos para recuperação e/ou alteração das proteínas musculares de pescados. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de hidrolisados protéicos de carne mecanicamente separada (CMS) de anchoita (Engraulis anchoita) e a avaliação da sua atividade antioxidante, aplicando-os bem embutido preparado com o surimi de anchoita. Foram produzidos diferentes hidrolisados com as enzimas microbianas Alcalase, Flavourzyme e Protamex, fixando a concentração de substrato e de enzima e os parâmetros pH e temperatura foram variados. Os hidrolisados foram efetivos contra a inibição da peroxidação lipídica (43,8±0,2%) e no poder redutor, onde o hidrolisado com a enzima Flavourzyme em 1 hora de reação mostrou-se mais efetivo. No seqüestro de radicais livres, como o DPPH, o hidrolisado com a enzima Flavourzyme, obtido em tempo de hidrólise de 5 horas, alcançou valores acima de 45,0% em concentração de 5 mg/mL. Na produção de surimi foram testadas lavagens da CMS de anchoita com soluções de bicarbonato de sódio 0,5%, ácido fosfórico 0,05% e cloreto de sódio 0,3%. O maior rendimento (90,5%) e uma coloração mais clara (W= 50,24±1,81) foram encontrados no surimi obtido por lavagens com bicarbonato de sódio e cloreto de sódio (BS), em comparação ao surimi que se utilizou água, ácido fosfórico e cloreto de sódio (AF) ou com soluções de cloreto de sódio, ácido fosfórico e bicarbonato de sódio (AB). Na força de gel o surimi AF (1154,25 ± 4,37 g.mm) obteve maior valor, sendo utilizado para a produção de salsichas. Foram analisadas diferentes concentrações de surimi (70, 75 e 80%) em salsichas, que foram submetidas às análises de cor e textura. Não houve influência da concentração de surimi nas características tecnológicas da salsicha, exceto nos valores de luminosidade. A salsicha com 75% de surimi de anchoita foi caracterizada pela composição proximal, valor energético total (VET) e conteúdo de sódio. A salsicha com surimi e comercial apresentou composição semelhante. O produto com surimi apresentou menor VET (193,7Kcal/100g) e conteúdo de sódio (520 mg/100g) que a salsicha comercial. Nas condições de estudo, no embutido emulsionado, não foi verificada ação antioxidante de hidrolisados, porém houve efeito sobre a CMS de anchoita.