Otimização da produção biotecnológica de lipases e correlação com a produção de biossurfactantes

As lipases e os biossurfactantes são compostos produzidos por microrganismos através de fermentações em estado sólido (FES) ou sumberso (FSm), os quais são aplicáveis nas indústrias alimentícia e farmacêutica, na bioenergia e na biorremediação, entre outras. O objetivo geral deste trabalho foi otimizar a produção de lipases através de fermentação em estado sólido e fermentação submersa. Os fungos foram selecionados quanto à habilidade de produção de lipases através de FES e FSm e aqueles que apresentaram as maiores atividades lipolíticas foram utilizados na seleção de variáveis significativas e na otimização da produção de lipases nos dois modos de cultivo. Foram empregadas técnicas seqüenciais de planejamento experimental, incluindo planejamentos fracionários, completos e a metodologia de superfície de resposta para a otimização da produção de lipases. As variáveis estudadas na FES foram o pH, o tipo de farelo como fonte de carbono, a fonte de nitrogênio, o indutor, a concentração da fonte de nitrogênio, a concentração do indutor e a cepa do fungo. Na FSm, além das variáveis estudadas na FES, estudaram-se as variáveis concentração inicial de inóculo e agitação. As enzimas produzidas foram caracterizadas quanto à temperatura e pH ótimos e quanto à estabilidade a temperatura e pH. Nas condições otimizadas de produção de lipases, foi avaliada a correlação entre a produção de lipases e bioemulsificantes. Inicialmente foram isolados 28 fungos. Os fungos Aspergillus O- 4 e Aspergillus E-6 foram selecionados como bons produtores de lipases no processo de fermentação em estado sólido e os fungos Penicillium E-3, Trichoderma E-19 e Aspergillus O-8 como bons produtores de lipases através da fermentação submersa. As condições otimizadas para a produção de lipases através de fermentação em estado sólido foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-4, farelo de soja, 2% de nitrato de sódio, 2% de azeite de oliva e pHs inferiores a 5, obtendo-se atividades lipolíticas máximas de 57 U. As condições otimizadas para a produção de lipases na fermentação submersa foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-8, farelo de trigo, 4,5% de extrato de levedura, 2% de óleo de soja e pH 7,15. A máxima atividade obtida durante a etapa de otimização foi 6 U. As lipases obtidas por FES apresentaram atividades máximas a 35ºC e pH 6,0, enquanto que as obtidas por FSm apresentaram ótimos a 37ºC e pH 7,2. A estabilidade térmica das lipases produzidas via FSm foi superior a das lipases obtidas via FES, com atividades residuais de 72% e 26,8% após 1h de exposição a 90ºC e 60ºC, respectivamente. As lipases obtidas via FES foram mais estáveis em pH´s alcalinos, com atividades residuais superiores a 60% após 24 h de exposição, enquanto as lipases produzidas via FSm foram mais estáveis em pH´s ácidos, com 80% de atividade residual na faixa de pH entre 3,5 e 6,5. Na fermentação submersa a correlação entre a produção de lipases e a atividade emulsificante óleo em água (O/A) e água em óleo (A/O) dos extratos foi 95,4% e 86,8%, respectivamente, obtendo-se atividades emulsificantes máximas O/A e A/O de 2,95 UE e 42,7 UE. Embora a maior produção de lipases tenha sido obtida na fermentação em estado sólido, não houve produção concomitante de biossurfactantes. Os extratos da fermentação submersa apresentaram redução da tensão superficial de 50 mN m -1 para 28 mN m -1 e atividade antimicrobiana frente ao microrganismo S. aureus ATCC 25923, com potenciais antimicrobianos de 36 a 43% nos três primeiros dias de fermentação. A fermentação submersa foi a técnica que apresentou os melhores resultados de otimização da produção de lipases, bem como de produção simultânea de biossurfactantes.

Produção de carboidratos a partir do efluente de laticínios tratado por cianobactéria

Nesta tese foi demonstrado o potencial de produção de carboidratos por Aphanothece microscopica Nägeli cultivada no efluente oriundo de uma indústria de laticínios. Para tanto, o trabalho é composto de quatro artigos que objetivaram avaliar a produção de carboidratos em função da temperatura, inóculo e razões C/N e N/P do elfluente, bem como a possibilidade de reúso da água residuária. Foram utilizadas temperaturas de (10, 20 e 30ºC) e inóculo (100, 200 e 300 mg.L-1). A melhor condição indicada foi quando utilizou-se a temperatura de 30°C e 200 mg.L-1 de inóculo. Na sequência, considerando a temperatura e a concentração celular selecionada, foi estudada a influência das razões C/N e N/P na produção de carboidratos. Para tal, C/N (20, 40 e 60) e N/P (5, 10 e 15) na produção de carboidratos extracelulares foram avaliadas em cultivos a 30°C, tendo como inóculo 200 mg.L-1. Os melhores resultados obtidos, foram quando foi utilizado C/N 60 e N/P 10. Uma vez definidas as melhores condições de produção de carboidratos, foi estudado o processo de separação de biomassa do meio de cultivo, a partir dos coagulantes FeCl3, Al2(SO4)3 e tanino. O efeito dos coagulantes na separação da biomassa foram estudados, quanto ao pH (6,0, 7,0 e 8,0) e concentração de coagulantes (50, 300 e 550 mg.L-1), utilizando como parâmetro de medida, a eficiência de remoção de DQO, turbidez e sólidos suspensos (SS). Os resultados demonstraram que as concentrações de coagulantes influenciaram significativamente ao nível de significância de 5 %, na separação da biomassa, com eficiência significativa na remoção da DQO, turbidez e SS. A melhor condição avaliada foi a que utilizou tanino na concentração de 300 mg.L-1 e pH 7,0, o que resultou em uma água residuária com remoção média de 96 % da turbidez, com potencial de ser reutilizada. Por fim, foi realizada a identificação de carboidratos gerados por Aphanothece microscopica Nägeli. Os resultados evidenciaram uma biomassa com até 33,5 % de carboidratos totais, perfazendo uma fração de carboidratos extracelulares, na fase estacionária de crescimento celular, de aproximadamente 25 % e 8 % os carboidratos da parede celular. Ficou demonstrado ainda que a composição dos carboidratos extracelulares do microorganismo em estudo é constituído por mono e dissacarídeos perfazendo concentrações na ordem de 12,88 % de glicose, 3,54 % de rafinose, 3,43 % sacarose, 2,13 % de frutose e 2,45 % de ribose. Ficou demonstrado o potencial de produção de carboidratos por Aphanothece microscopica Nägeli quando cultivada no efluente da indústria de laticínios.

Desenvolvimento de filmes nanocompósitos de isolado protéico de corvina (micropogonias furnieri) e argila organofílica

O desenvolvimento de filmes e coberturas é um processo de transformação que utiliza polímeros capazes de formar uma matriz contínua. As proteínas de pescado apresentam propriedades que são vantajosas no preparo de biofilmes, como habilidade para formar redes, plasticidade e elasticidade, apresentando boa barreira ao oxigênio, mas sua barreira ao vapor de água é baixa devido à sua natureza hidrofílica. Estas propriedades podem ser melhoradas aplicando nanotecnologia, incluindo materiais como as nanoargilas. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver filmes nanocompósitos a partir de biopolímeros protéicos provenientes de isolados protéicos de corvina (Micropogonias furnieri) e argilas organofílicas. O isolado protéico de corvina (IPC) foi obtido utilizando processo de variação de pH para solubilizar e isolar proteína. Os filmes poliméricos foram desenvolvidos pela técnica de “casting”. Para o desenvolvimento de filmes nanocompósitos de isolado protéico de corvina (IPC) e montmorilonita foi executado um planejamento experimental de 3 níveis e 3 fatores com 3 réplicas no ponto central. Os resultados foram submetidos à metodologia de superfície de resposta (MSR) para estudar os efeitos simultâneos das variáveis independentes, concentração de IPC (IPC = 2; 3,5 e 5 g/100 g de solução filmogênica); concentração de montmorilonita (MMT = 0,3; 0,5 e 0,7 g/100 g de solução filmogênica); e plastificante glicerol (G = 25, 30 e 35 g/100 g de IPC em base seca) sobre as respostas resistência à tração (MPa), elongação (%), força na ruptura (N), permeabilidade ao vapor de água (g mm m-2 d -1 KPa-1 ) e solubilidade (%). O isolado protéico obtido de carne mecanicamente separada de corvina apresentou 97,87% de proteína (em base seca), boa capacidade de retenção de água e solubilidade. Os valores de resistência à tração variaram entre 7,2 e 10,7 MPa e os valores de elongação de 39,6 a 45,8%. Os valores encontrados para PVA no presente trabalho encontram-se entre 3,2 e 5,5 g mm m-2 d -1 KPa-1 . Os filmes nanocompósitos produzidos a partir de IPC e MMT foram promissores, do ponto de vista das propriedades mecânicas, aparência visual e fácil manuseio, bem como baixa permeabilidade ao vapor de água e a baixa solubilidade. Com relação às propriedades mecânicas, a concentração de IPC e MMT foi o principal fator que influenciou no desenvolvimento dos filmes nanocompósitos. O planejamento experimental utilizado determinou que 3,5 g de IPC; 0,5 g de MMT e 30 (g/100g de IPC) de glicerol seriam os parâmetros ideais para desenvolvimento de filmes nanocompósitos utilizando a técnica de “casting”. As coberturas de isolado protéico de corvina (IPC) e as coberturas de IPC e MMT foram aplicadas em mamão minimamente processado para avaliar sua vida- útil. O revestimento com cobertura de isolado protéico de corvina e montmorilonita aplicado em mamão minimamente processado apresentou menor perda de massa 5,26%, menor crescimento microbiano e menor diminuição de firmeza, luminosidade e pH conseqüentemente apresentou os melhores resultados na cobertura de mamão minimamente processado, quando comparados com a amostra controle sem cobertura.

Produção de lipídios microbianos a partir de glicerol bruto gerado na síntese de biodiesel

Diante da grande quantidade de glicerol bruto gerado na síntese do biodiesel e seu baixo valor comercial, torna-se fundamental encontrar formas alternativas para converter este substrato em produtos com valor agregado. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar diferentes leveduras oleaginosas capazes de metabolizar o glicerol bruto, gerado como coproduto na síntese de biodiesel, visando produzir biomassa como fonte de lipídios. Todos os cultivos foram realizados em frascos agitados, em condições estabelecidas de acordo com cada etapa do trabalho, sendo obtidos dados relativos ao crescimento celular e à produção de lipídios, tratados estatisticamente conforme o propósito. Lipomyces lipofer NRRL Y-1155 apresentou diferenças significativas em relação às outras leveduras oriundas de banco de cultura, atingindo 57,64% de lipídios na biomassa. Estas leveduras apresentarem perfis de ácidos graxos diferenciados, semelhantes aos dos principais óleos vegetais utilizadas na síntese de biodiesel, com predominância de ácidos graxos poli-insaturados, especialmente ácido linoleico (68,3% na levedura Rhodotorula glutinis NRRL YB-252). O ácido gama-linolênico, um ácido graxo essencial ω6, foi detectado em todas as leveduras analisadas, sendo que na biomassa de Candida cylindracea NRRL Y-17506 chegou a 23,1%. Através de um planejamento experimental Plackett-Burman, verificou-se que as variáveis concentração de extrato de levedura e de MgSO4.7H20 demonstraram maior influência na produção de lipídios por uma linhagem silvestre de Rhodotorula mucilaginosa. Para esta levedura, a partir da análise de efeitos foi possível estabelecer a seguinte condição para a produção de lipídios: 30,0 g.L-1 glicerol; 5,0 g.L-1 KH2PO4; 1,0 g.L-1 Na2HPO4; 3,0 g.L-1 MgSO4.7H2O; 1,2 g.L-1 extrato de levedura; pH inicial 4,5; temperatura 25°C. Nestas condições conseguiu-se um teor de lipídios de 59,96% e lipídios totais produzidos de 5,51 g.L-1 . Também foi possível observar aumento no teor de lipídios da biomassa ao longo do tempo de cultivo, bem como o aumento do teor relativo do ácido linoleico, que atingiu 52%. Dentre as leveduras isoladas a partir de amostras ambientais do Extremo Sul do Brasil, a levedura identificada como Cryptococcus humicola se destacou das demais, apresentando proporção de 23,5% de ácidos graxos saturados, 14,8% de ácidos graxos monoinsaturados e 54,9% de ácidos graxos poli-insaturados, destacando-se o ácido linoleico. O planejamento Plackett-Burman foi também utilizado para esta levedura, sendo que as variáveis concentração de extrato de levedura e glicerol bruto demonstraram maior influência na produção de lipídios. Posteriormente, um delineamento composto central rotacional (DCCR) foi proposto visando à otimização da produção de lipídios. Os modelos empíricos preditivos obtidos para biomassa máxima e lipídios totais permitiram estabelecer para a produção de lipídios por Cryptococcus humicola a seguinte condição otimizada: 100,0 g.L-1 glicerol; 5,0 g.L-1 KH2PO4; 1,0 g.L-1 Na2HPO4; 4,8 g.L-1 extrato de levedura; pH inicial 4,5; temperatura 25°C. Esta condição representou um incremento de cerca de 2 vezes nos lipídios totais em relação à melhor condição estabelecida pelo planejamento Plackett-Burmann e um acréscimo de cerca de 4,8 vezes em relação às condições testadas inicialmente, atingindo 37,61% de lipídios e 8,85 g.L-1 de lipídios totais. Deste modo, os propósitos de valorização de um coproduto oriundo da síntese de biodiesel, bem como a produção de um óleo com potencial para a produção de biodiesel, foram cumpridos.