Identificação do transcrito CYP1A no peixe Phalloceros caudimaculatus e resposta para a exposição a beta-naftoflavona e amostras ambientais de sedimento

Contaminantes orgânicos, como os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), podem atingir corpos da água e possuem potencial para causar efeitos tóxicos em organismos. A exposição aos HPAs causa indução nos níveis de citocromo P450 1A (CYP1A) em peixes, e portanto, é utilizado como um biomarcador de contaminação ambiental. O guarú Phalloceros caudimaculatus ocorre naturalmente em ambientes aquáticos dulcícolas e mixohalinos na América do Sul. O presente estudo identificou a sequência nucleotídica do transcrito CYP1A de P. caudimaculatus, que codifica uma proteína com 521 aminoácidos, e que apresenta 91% e 70% de identidade com CYP1A de killifish e paulistinha, respectivamente. A partir desta sequência foi possível realizar a avaliação dos níveis de mRNA de CYP1A deste peixe por RTq-PCR. Foi realizada uma caracterização de sua indução órgão- e tempo-dependente frente a exposição ao HPA beta-naftoflavona (BNF) e ao elutriato preparado a partir de sedimento de dois corpos da água possivelmente contaminados com HPAs. Foi constatado um aumento significativo nos níveis de mRNA de CYP1A em fígado, brânquia, intestino, cérebro, nadadeira anal de macho adultos e em alevinos na primeira hora de exposição a 1 µM de BNF, em relação ao grupo controle. O rim e as nadadeiras caudal e dorsal apresentaram indução de CYP1A após duas horas de exposição ao BNF. As maiores induções nos peixes dos grupos expostos ao BNF em relação ao controle foram de 176 no rim e 122 vezes no cérebro, observadas respectivamente após 8 e 48 horas de exposição. Os níveis de mRNA de CYP1A nos órgãos e tecidos de alevino, mantiveramse induzidos pela exposição ao BNF até o final das 96 horas de exposição. A exposição dos peixes ao elutriato produzido a partir dos sedimentos coletados em dois locais potencialmente contaminados causou indução do CYP1A no fígado de 22 e 122 vezes em relação ao controle. Os resultados demonstram que a indução de CYP1A em Phalloceros caudimaculatus ocorre em tempos curtos de exposição, além da variação de acordo com o tempo de exposição e com o órgão analisado. Além disso, foi demonstrado que tecidos externos também podem ser utilizados para tais análises e que o elutriato feito a partir de sedimento de locais que recebem descargas de contaminantes podem causar indução de CYP1A nos organismos.

Avaliação da técnica de dispersão da matriz em fase sólida assistida por vórtex para análise de fármacos em peixes

Os fármacos classificados como contaminantes orgânicos emergentes tornaramse tópico de discussão ambiental pois estes são capazes de atingir diferentes matrizes do meio ambiente, como água, solo e organismos aquáticos, e estudos demonstrando a toxicidade tem despertado o interesse científico. Neste estudo um método analítico foi otimizado e validado para determinação de quinze fármacos em amostras de peixes empregando preparo de amostras por dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) assistida por vórtex e determinação por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS). O estudo ainda focou na aplicação de diferentes suportes sólidos na etapa de dispersão da MSPD, sendo que três (quitina, quitosana e concha de mexilhão dourado) foram utilizados pela primeira vez para esta finalidade, O método otimizado foi validado seguindo os parâmetros do INMETRO, ANVISA, SANCO e FDA. A curva analítica e linearidade foram avaliados através da calibração externa e superposição na matriz. Os compostos demonstraram linearidade dentro da faixa recomendada, com coeficiente de correlação maior do que 0,99. Os limites de detecção do método variaram de 1 a 100 ng g -1 , e os limites de quantificação a variaram de 5 a 1000 ng g -1 . Os valores de recuperação variaram de 68% a 108%, com RSD menores que 13% para todos os compostos. O efeito de matriz foi avaliado e quatro dos quinze compostos apresentaram efeito maior que ±20%. Na aplicabilidade o método demonstrou ser eficiente para extração de fármacos de diferentes espécies de peixe, apresentando exatidão e precisão adequados. Não foram encontrados resíduos de fármacos nas amostras analisadas.

Atividade colinesterásica no monitoramento ambiental: importância da determinação de parâmetros cinéticos em peixes estuarinos

Neste trabalho foram analisados os parâmetros cinéticos e a atividade colinesterásica de duas espécies de peixes estuarinos: a corvina Micropogonias furnieri (Teleostei, Scianidae) e o bagre Cathorops spixii (Teleostei, Ariidae), buscando avaliar o uso destas espécies como bioindicadores da presença de compostos anticolinesterásicos no meio aquático. Os exemplares de corvina e bagre, respectivamente, foram coletados nos estados do RS (Lagoa dos Patos) e PR (Baía de Paranaguá) no inverno (corvina) e verão (corvina e bagre) em dois pontos de coleta: um local controle e outro poluído. Os peixes foram anestesiados (bezocaína, 200 ppm) e os cérebros dissecados, homogeneizados e centrifugados. Foram estimados os parâmetros cinéticos (Vmax e Kmap), utilizando iodeto de acetiltiocolina como substrato, nas seguintes concentrações: 0,025; 0,05; 0,2; 0,8; 1,6; 3,2 e 9 mM. Nos estudos de inibição enzimática foi utilizado o carbamato eserina em concentrações de 0,3 a 10 mM e de 1x10-4 a 1 µM, a fim de determinar os parâmetros cinéticos de inibição e a concentração de eserina que inibia 50% da atividade colinesterásica (CI50), respectivamente. Os resultados mostraram pouca variação nos valores de Kmap nas duas espécies, porém diferenças significativas nos valores de CI50 foram observadas, indicando que a ChE do cérebro da corvina M. furnieri é resistente à inibição por eserina. Nos estudos de cinética de inibição da ChE do cérebro do bagre C. spixii, foram encontradas diferenças entre alguns parâmetros, quando foram comparados os peixes coletados no local controle com aqueles coletados no local poluído. Houve uma maior atividade colinesterásica de bagres coletados no local poluído (p<0,05), sendo que o mesmo resultado foi observado em exemplares de corvinas M. furnieri coletados durante o inverno no local poluído. Os resultados obtidos in vitro demonstram que a ChE de M. furnieri possui pouca sensibilidade à eserina. 5 Porém, o fato de ter sido registrada inibição colinesterásica nos organismos coletados durante o verão região poluída sugere a possibilidade de alterações significativas na capacidade de bio-oxidação de pesticidas nesta espécie, ou a possibilidade de inibição por outros contaminantes que também afetam a atividade colinesterásica, como por exemplo, metais. No caso de C. spixii, a determinação dos parâmetros cinéticos e de atividade colinesterásica sugere que pode estar ocorrendo alterações bioquímicas nos peixes previamente expostos a contaminantes no ambiente, provavelmente devido a respostas adaptativas ao ambiente impactado. Desta forma, o presente estudo indica a importância de estudos cinéticos prévios, quando se utiliza ou pretende utilizar, a atividade colinesterásica como bioindicador da presença de compostos anticolinesterásicos no ambiente em espécies aquáticas.