Síntese, extração e caracterização de biopolímeros de origem microalgal para desenvolvimento de nanofibras

Pesquisas com microalgas estão crescendo devido aos possíveis bioprodutos oriundos de sua biomassa, bem como as suas diferentes aplicabilidades. Microalgas podem ser cultivadas para a produção de biopolímeros com características de biocompatibilidade e biodegradabilidade. Nanofibras produzidas por electrospinning a partir de poli-β-hidroxibutirato (PHB) geram produtos com aplicabilidade na área de alimentos e médica. O objetivo deste trabalho foi selecionar microalgas com maior potencial para síntese de biopolímeros, em diferentes meios de cultivo, bem como purificar poli-β-hidroxibutirato e desenvolver nanofibras. Este trabalho foi dividido em cinco artigos: (1) Seleção de microalgas produtoras de biopolímeros; (2) Produção de biopolímeros pela microalga Spirulina sp. LEB 18 em cultivo com diferentes fontes de carbono e redução de nitrogênio; (3) Síntese de biopolímeros pela microalga Spirulina sp. LEB 18 em cultivos autotróficos e mixotróficos; (4) Purificação de poli-β- hidroxibutirato extraído da microalga Spirulina sp. LEB 18; e (5) Produção de nanofibras a partir de poli-β-hidroxibutirato de origem microalgal. Foram estudadas as microalgas Cyanobium sp., Nostoc ellipsosporum, Spirulina sp. LEB 18 e Synechococcus nidulans. Os biopolímeros foram extraídos nos tempos de 5, 10, 15, 20 e 25 d de cultivo a partir de digestão diferencial. Para os experimentos com diferentes nutrientes, foi utilizado como fonte de carbono, bicarbonato de sódio, acetato de sódio, glicose e glicerina modificando-se as concentrações de nitrogênio e fósforo. Os cultivos foram realizados em fotobiorreatores fechados de 2 L. A concentração inicial de inóculo foi 0,15 g.L-1 e os ensaios foram mantidos em estufa termostatizada a 30 ºC com iluminância de 41,6 µmolfótons.m -2 .s -1 e fotoperíodo 12 h claro/escuro. Para a purificação de PHB, foi utilizada a biomassa da cianobactéria Spirulina sp. LEB 18, cultivada em meio Zarrouk. Após a extração do biopolímero bruto, a amostra foi desengordurada com hexano e purificada com 1,2-carbonato de propileno. Foram determinadas as purezas e as propriedades térmicas no PHB purificado. O biopolímero utilizado para produzir as nanofibras apresentava 70 % de pureza. A técnica para produção de nanofibras foi o electrospinning. As microalgas que apresentaram máxima produtividade foram Nostoc ellipsosporum e Spirulina sp. LEB 18 com rendimento de biopolímero 19,27 e 20,62 % em 10 e 15 d, respectivamente, na fase de máximo crescimento celular. O maior rendimento de biopolímeros (54,48 %) foi obtido quando se utilizou 8,4 g.L-1 de NaHCO3, 0,05 g.L-1 de NaNO3 e 0,1 g.L-1 de K2HPO4. A condição que proporcionou maior pureza do PHB foi a 130 ºC e 5 min de contato entre o solvente (1,2-carbonato de propileno) e o PHB. As análises térmicas para todas as amostras foram semelhantes em relação ao PHB padrão (Sigma-Aldrich). A purificação com 1,2-carbonato de propileno foi eficiente para o PHB extraído de microalga, alcançando pureza acima de 90 %. A condição que apresentou menores diâmetros de nanofibras foi ao utilizar solução contendo 20 % de biopolímero solubilizado em clorofórmio. As condições do electrospinning que apresentou nanofibras com diâmetros de 470 e 537 nm foram, vazão 150 µL.h-1 , diâmetro do capilar 0,45 mm e voltagens entre 24,1 e 29,6 kV, respectivamente. A microalga Spirulina sp. LEB 18 produz PHB ao utilizar menores concentrações de nutrientes no meio de cultivo, que pode ser purificado com 1,2-carbonato de propileno. Este biopolímero possui aplicabilidade para produção de nanofibras.

Cultivo de microalgas utilizando pentoses como fonte de carbono

As microalgas podem ser consideradas como um dos mais eficientes sistemas biológicos de transformação de energia solar em compostos orgânicos. Quando cultivadas em meios adequados, certas espécies podem duplicar sua biomassa diariamente. Além disso, possuem inúmeras vantagens, como: elevada velocidade de crescimento; potencial para absorver CO2, reduzindo assim a quantidade de emissões deste gás na atmosfera e diminuindo o efeito estufa. O objetivo do trabalho foi estudar o efeito do uso de pentoses no cultivo de Chlorella minutissima, Chlorella vulgaris, Chlorella homosphaera, Dunaliella salina, Spirulina paracas e Synechococcus nidulans, avaliando o perfil cinético do crescimento e a capacidade de produção de carboidratos e proteínas. Para o cultivo das microalgas foram utilizados os meios: Zarrouk, Bristol`S Modificado e DUN. Em todos os meios o componente nitrogenado foi reduzido pela metade e utilizado 1%, 5%, 10%, 20% e 30% de pentoses, com concentrações de xilose e arabinose que representassem as mesmas presentes em caldo hidrolisado do bagaço de cana de açúcar pré-tratado. Os cultivos foram realizados em fotobiorreatores de 2 L, mantidos em estufa a 30 ºC, fotoperíodo de 12h claro/escuro e 2500 Lx, com agitação a uma vazão de 0,75 v.v.m. . O crescimento de biomassa foi monitorado diariamente pela densidade ótica das culturas em espectrofotômetro a 670nm. Foram avaliados parâmetros cinéticos como a concentração máxima de biomassa, produtividade máxima e velocidade específica máxima de crescimento. A determinação do consumo das pentoses foi realizada através da metodologia de Somogy e Nelson, para a determinação de carboidratos foi utilizada uma adaptação do método do ácido 3,5 dinitro salicílico, as proteínas foram quantificadas pelo método de micro-Kjeldahl. Todas as microalgas foram capazes de consumir em no máximo quatro dias as concentrações de pentoses, e logo após esta etapa mixotrófica manter-se em crescimento autotrófico, destacando-se as cepas de Dunaliella salina e Synechococcus nidulans que esgotaram as maiores concentrações utililizadas em dois dias de cultivo. Para as cianobactérias estudadas, Spirulina paracas cultivada com 10% de C5, foi a que obteve os melhores resultados de concentração celular, produtividade e velocidade específica de crescimento máxima, 1,364 g.L-1 , 0,128 g.L-1 .dia-1 e 0,240 dia-1 . Em relação ao efeito na composição da biomassa, Synechococcus nidulans produziu o maior teor de proteínas, 62,9%, nos ensaios com 10% de C5. Já as cepas de Chlorophytas os melhores resultados foram obtidos com o uso de 5% de C5, para os parâmetros cinéticos destacam-se os valores encontrados para Dunaliella salina, onde a maior concentração de biomassa, produtividade e velocidade específica de crescimento foram 1,246 g.L-1 , 0,091 g.L- 1 .dia-1 e 0,379 dia-1 , respectivamente. Chlorella minutissima e Dunaliella salina foram as melhores produtoras de carboidratos, alcançando 58,6%/0,3 g.L-1 e 23,07%/0,29 g.L-1 ,respecivamente. Logo, o uso de pentoses nas microalgas em substituição as fontes tradicionais de carbono, resultou no crescimento das mesmas, o que mostra que estas podem agir como intermediários para a absorção de açúcares de cinco carbonos.

Interação da cianotoxina microcistina e o nanomaterial de carbono fulereno (C60) em brânquias do peixe Cyprinus carpio (Teleostei: Cyprinidae) sob incidência de radiação UVA

A produção mundial de nanomateriais tem aumentado nos últimos anos, em função de suas variadas aplicações tecnológicas e, como consequência do seu crescente uso e demanda, poderão existir riscos ambientais sendo a água o ambiente onde muitas destas substâncias podem exercer efeitos deletérios. Um dos nanomaterias de carbono mais utilizados é o fulereno, um composto orgânico lipofílico que pode se comportar como carreador de moléculas tóxicas, potencializando a entrada de contaminantes ambientais em órgãos específicos, fenômeno conhecido como “cavalo de Troia”. As microcistinas (MC) são cianotoxinas produzidas por cianobactérias durante episódios de floração, afetando aos organismos aquáticos e ao ser humano. Diversos estudos demonstram que organismos expostos tanto às MCs quanto ao fulereno podem causar produção excessiva de espécies ativas de oxigênio e alterar os níveis de antioxidantes. Além disso, outro fator que pode vir a intensificar o potencial tóxico de ambos é a incidência de radiação UVA. Sendo assim, procurou-se avaliar os efeitos em parâmetros de estresse oxidativo da co-exposição ex vivo da cianotoxina microcistina-LR (MC-LR) e o nanomaterial de carbono fulereno em brânquias do peixe Cyprinus carpio sob incidência de radiação UVA. Os resultados mostraram que: (a) houve uma perda da capacidade antioxidante no tratamento com MC-LR (baixa concentração) quando coexposta com fulereno no UVA em relação com o tratamento realizado sem co-exposição com fulereno; (b) o fulereno no UV diminuiu a atividade da enzima glutationa-Stransferase (GST) quando comparado com o controle no UV; (c) a MC-LR (alta concentração) co-exposta com fulereno foi capaz de diminuir as concentrações do antioxidante glutationa (GSH) quando comparado com o mesmo tratamento tanto no UVA quanto no escuro sem a co-exposição ao fulereno; (d) o tratamento MC-LR (baixa concentração) com UVA aumentou o dano oxidativo lipídico quando comparado com o controle UVA; (e) o fulereno não causou uma maior bioacumulação da microcistina no tecido. Sendo assim, pode-se concluir que o fulereno não apresentou o potencial de carregador de moléculas nessas concentrações de microcistina, porém, a co-exposição dos compostos diminuem tanto capacidade antioxidante total, como a concentração da GSH, podendo gerar problemas a longo prazo na detoxificação da toxina.

Nanofibras de isolado proteico de bijupirá (rachycentron canadum): desenvolvimento, caracterização e avaliação toxicológica

As nanofibras produzidas através de biopolímeros oriundos de materiais biológicos têm tomado espaço no âmbito mundial, estes podem ter sua origem em compostos como a proteína animal, por exemplo, as proteínas de pescado. O presente trabalho teve como objetivo geral desenvolver nanofibras de isolado proteico de Bijupirá (Rachycentron canadum). O isolado proteico de bijupirá (IPB) foi obtido utilizando processo de variação de pH para solubilizar e isolar proteínas. O IPB obtido foi caracterizado quanto sua composição química proximal e suas propriedades físicoquímicas, estruturais e funcionais. O rendimento do IPB foi de 98,17% de proteína, em base seca. A maior solubilidade e a maior capacidade de retenção de água (CRA) do IPB foram obtidas em pH 11 e 21,9 mL.g-1 de proteína, respectivamente. Os perfis eletroforéticos revelaram massas moleculares características de proteínas miofibrilares (miosina e actina). Os principais picos identificados pelas análises de Espectroscopia na Região do Infravermelho (FTIR) são provenientes de ligações peptídicas (ligações amida), como Amida I e II. Os maiores pontos de fusão e de degradação do IPB foram de 259,1°C e 378°C, respectivamente, obtendo assim, um isolado proteico com elevada estabilidade térmica. As nanofibras foram desenvolvidas pela técnica de electrospinnig. Foram preparadas soluções poliméricas utilizando 1% (p/v) de óxido de polietileno (PEO) e 1, 2, 3, 4, 5 e 6% (p/v) de IPB. Os parâmetros utilizados no processo de electrospinning como: potencial elétrico, distância da ponta do coletor a agulha e a taxa de fluxo da solução foram fixados em 16,7 kV, 15 cm, e 150 µL.h-1 , respectivamente. Os efeitos do solvente e a adição de um biopolímero comercial na capacidade de formação e morfologia das nanofibras foram estudados. Em relação ao efeito do solvente na solubilização das proteínas, o processo de electrospinning foi favorecido quando utilizado o ácido fórmico 85% (v/v), como este solvente orgânico promove a formação de estruturas helicoidais aleatórias e, consequentemente, um aumento no emaranhado de biopolímeros. A adição do biopolímero PEO proporcionou melhor viscosidade às soluções de IPB e o desenvolvimento das nanofibras. A morfologia analisada por Microscopia eletrônica de Varredura (MEV) das nanofibras obtidas com 5 e 4% (p/v) de IPB e 1% (/v) de PEO foi de 205 ± 82 nm e 476 ± 107, respectivamente.

Purificação de C-ficocianina e sua incorporação em nanofibras

C-ficocianina (C-FC) é uma ficobiliproteína, de cor natural azul, com diversas aplicações na indústria alimentícia, farmacêutica e biomédica, dependendo do seu grau específico de pureza, que pode variar de 0,7 a 4,0, com respectivo aumento de seu valor comercial. Essa pureza é alcançada através de diversas técnicas de purificação, que podem ser aplicadas em diferentes sequências. Um destes processos de purificação de proteínas baseia-se na cromatografia de troca iônica, que utiliza trocadores que adsorvem as proteínas como resultado de interações iônicas entre a superfície da proteína e o trocador. Resinas e colunas de leito expandido podem ser utilizadas para aumentar a produtividade dessa técnica. É fundamental conhecer o perfil do processo de adsorção, para melhor aplicá-lo como ferramenta para o design e otimização de parâmetros operacionais. Outra tecnologia para o tratamento de biomoléculas é a ultrafiltração. Esta técnica é aplicável em larga escala, apresenta baixa complexidade de aplicação e pode ser realizada em condições brandas, minimizando o dano para o produto. Para aumentar a estabilidade da C-FC, e facilitar a sua aplicação, podem ser avaliadas técnicas recentes, não exploradas para este fim, como as nanofibras obtidas através do processo de electrospinning. Estas fibras possuem uma área superficial específica extremamente elevada devido a seu pequeno diâmetro. O objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros de adsorção e diferentes técnicas para purificação de C-ficocianina de Spirulina platensis e obter nanofibras poliméricas incorporadas de C-ficocianina. O trabalho foi dividido em quatro artigos. No primeiro artigo, foram avaliados os parâmetros e as isotermas de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica para leito expandido Streamline® DEAE. Verificou-se que o maior coeficiente de partição foi obtido em pH 7,5, nas temperaturas de 15 e 25 °C. As isotermas de adsorção da Cficocianina foram bem representadas pelos modelos de Langmuir, de Freundlich e de Langmuir-Freundlich, sendo os valores estimados para Qm e Kd obtidos pela isoterma de Langmuir foram, respectivamente, 33,92 mg.mL-1 e 0,123 mg.mL-1, respectivamente. No segundo artigo foi avaliada a purificação de C-FC até grau alimentar, utilizando ultrafiltração (UF). Com a membrana de 50 kDa, identificou-se que somente a temperatura e a aplicação de diferentes ciclos de diafiltração (DF) causaram influência significativa sobre a purificação e recuperação da C-ficocianina. Foram então aplicados o aumento gradativo da quantidade de ciclos, e a diafiltração previamente à ultrafiltração (DF/UF), onde obteve-se um extrato de Cficocianina com pureza de 0,95. No terceiro artigo foram propostos processos de purificação, envolvendo a utilização das diferentes técnicas para obtenção de C-FC com diferentes purezas. Determinou-se que a partir de cromatografia de troca iônica em leito fixo seguido de DF/UF, obtém-se C-FC para uso em cosméticos e a partir de precipitação com sulfato de amônio, e DF/UF obtém-se C-FC para uso em biomarcadores. Com uma sequência de precipitação com sulfato de amônio, DF/UF e cromatografia de troca iônica em leito fixo chega-se a C-FC de grau analítico. No último artigo, C-FC foi incorporada a nanofibras de óxido de polietileno (PEO) através de processo de electrospinning. Foram determinadas a condutividade da solução de C-FC/PEO, a estrutura e comportamento termogravimétrico das nanofibras formadas. Soluções de polímeros com concentração de 6 e 8% proporcionaram a formação de nanofibras com diâmetro médio inferior a 800 nm, homogêneas, sem a presença de gotas. A análise termogravimétrica identificou aumento na resistência térmica da C-FC incorporada nas fibras.

Influência dos ácidos graxos do tipo ômega-3 ou ômega-6 e o nanomaterial de carbono fulereno (C60) no estado antioxidante em suspensões celulares de cérebro de Cyprinus carpio (Pisces, Cyprinidae)

Os nanomateriais de carbono como o fulereno (C60) apresenta comportamentos bioquímicos distintos, podendo atuar como antioxidante ou pró-oxidante em diferentes sistemas biológicos. Outra evidência ao C60 refere-se a sua característica lipofilica, na qual oferece ação mais direta a diferentes tipos de membranas celulares. Do mesmo modo ácidos graxos poliinsaturados (AGPs) como o ômega-3 (DHA) e o ômega-6 (LA) são importantes para funções celulares da membrana, sendo considerados antioxidantes clássicos. Dessa forma este estudo avaliou em suspensões celulares de cérebro da carpa (Cyprinus carpio, Cyprinidae), o efeito de C60 após um pré-tratamento com DHA ou LA. Para tal avaliação os ensaios consistiram em um pré-tratamento com AGPs (48h) e após exposição a C60 (2h). Como resultados observamos que a viabilidade celular e a capacidade antioxidante total não apresentaram diferença (p> 0.05) entre todos os grupos. Em relação a valores de espécies ativas de oxigênio e dano lipídico foi observado redução nos seus valores nos grupos expostos ao C60 pré – tratados com AGPs (p<0.05). Em termos de cisteína, ocorre uma redução da sua concentração em todos os grupos expostos ao C60. Porém para glutationa a exposição ao C60 provoca um aumento de sua concentração nos grupo controle (sem AGPs) e no grupo pré – tratado com DHA. Dessa forma consideramos que o pré – tratamento com AGPs é benéfico às células, uma vez que um aumento nos níveis de glutationa e uma diminuição na concentração de espécies ativas de oxigênio e peroxidação lipídica foram observados nos grupos expostos ao C60. Sendo assim um bom estado nutritivo em termos da concentração de AGPs foi considerado benéfico na exposição ao fulereno.

Utilização de diferentes fontes de carbono no cultivo do camarão litopenaeus vannamei em sistemas com bioflocos

A tecnologia do sistema de cultivo com bioflocos (BFT) permite a intensificação da densidade de estocagem, bem como o aumento da produtividade no qual exige esforços no manejo para a manutenção de qualidade de água. No entanto, um dos problemas é a liberação de nitrogênio através de alimento não consumidos, juntamente com as excretas dos organismos cultivados, principalmente na forma de amônia total. A adição de fontes de carbono orgânico é uma alternativa na redução de amônia tornando possível a conversão deste composto em proteína bacteriana, sendo disponível como alimento suplementar no ambiente de cultivo. Portanto foram testadas fontes de carbono como o melaço de cana-de-açúcar, dextrose e farelo de arroz no cultivo do camarão L. vannamei em sistemas BFT, avaliando a redução da concentração do nitrogênio amoniacal total em experimentos nas fases de berçário e engorda, bem como a análise de desempenho zootécnico dos animais. Os experimentos foram realizados utilizando caixas com volume útil de 800 L. O experimento berçário teve a duração de 35 dias, com densidade de estocagem de 1200 camarões m- ² e peso médio de 0,024±0,01 g. As fontes de carbono melaço de cana-de-açúcar (M) e farelo de arroz (F) foram combinadas em diferentes percentuais. No experimento engorda foi utilizada densidade de estocagem de 300 camarões m- ², peso médio de 4,09±0,51 g, durante 70 dias. Os tratamentos foram distinguidos pelas fontes de carbono dextrose e farelo de arroz. No experimento berçário a concentração da amônia foi significativamente menor (p<0,05) com o uso do melaço. O nitrito acumulou até o final do experimento, mas devido ao curto período experimental não interferiu nos índices de desempenho zootécnico, nos quais não apresentaram diferenças pelo uso das fontes de carbono. No experimento engorda, com o uso da dextrose, a concentração de amônia foi significativamente menor (p<0,05). Apesar de elevadas concentrações de nitrito, as sobrevivências foram similares e acima de 80%. Dados zootécnicos como peso final, ganho de peso semanal, conversão alimentar aparente e produtividade foram significativamente melhores (p<0,05) no tratamento farelo de arroz. Em ambos os experimentos as fontes de carbono de degradação rápida, como o melaço e a dextrose foram mais eficientes na redução de amônia. A degradação rápida destas fontes podem ter disponibilizado maiores teores de carbono como substrato para as bactérias heterotróficas metabolizarem a amônia, melhorando a qualidade da água.

Nanotubos de carbono de parede simples funcionalizados com polietilenoglicol: avaliação de parâmetros in vivo e in vitro

Os nanomateriais apresentam uma escala na qual ao menos uma das dimensões varia entre 1 e 100 nm e possuem propriedades químicas, físicas ou biológicas dependentes da nanoestrutura e que lhes confere características funcionais de interesse para fins comerciais ou aplicações na área médica. Dentre os nanomateriais mais estudados e utilizados, destacam-se os de carbono, que incluem os fulerenos e os nanotubos de carbono (NT). Uma potencial utilização dos nanomateriais de carbono é na área biomédica, já que estes podem interagir com os sistemas biológicos em nível molecular e supramolecular com alto grau de especificidade. Em contrapartida, é importante considerar que os nanotubos de carbono podem exercer efeitos tóxicos, tendo como possível mecanismo o estresse oxidativo. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi investigar a ação dos nanotubos de carbono de parede única funcionalizados com polietilenoglicol (SWNT-PEG) em Danio rerio “zebrafish” (Teleostei, Cyprinidae). Avaliaram-se parâmetros bioquímicos, histológicos, comportamentais e de biodistribuição para entender como esse material se comporta in vitro e in vivo. Foi observado que o tipo de funcionalização é determinante para a ação desse material em meio biológico. No experimento in vitro o SWNT-PEG não mostrou efeito pró-oxidante nas avaliações de peroxidação lipídica, capacidade antioxidante total, conteúdo de GSH e atividade de GCL. Na exposição intraperitoneal em zebrafish constatou-se a agregação e geração de processo inflamatório, o que sugere que a cadeia de PEG utilizada para a funcionalização dos NT possui um tamanho inadequado e/ou uma funcionalização ineficiente para manter a estabilidade do material em meio biológico e evitar uma resposta inflamatória por parte do organismo exposto. Possivelmente devido a esta característica do nanomaterial, nas análises de biodistribuição, através de espectroscopia Raman, não se observou distribuição de SWNT-PEG no sistema nervoso central de zebrafish. No entanto, através da análise histológica foi observado processo inflamatório no tecido nervoso central, bem como alterações comportamentais avaliadas na tarefa de campo aberto.