Redução dos níveis de Ocratoxina A por ação da enzima peroxidase

A ocratoxina A é um composto formado a partir do metabolismo secundário de fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. Uma vez que a presença dessa micotoxina nos alimentos causa sérios danos à saúde humana e animal, surge o interesse pelo desenvolvimento de métodos que visem a redução dos seus níveis em diferentes matrizes. Diversos processos de descontaminação têm sido propostos, sendo que os métodos de redução biológica tem recebido destaque. Esses métodos consistem na aplicação de micro-organismos ou de suas enzimas, o que gera a biotransformação ou degradação da toxina produzindo metabólitos com menor ou nenhuma toxicidade. Diante disso, o objetivo geral do trabalho foi avaliar o efeito da peroxidase na redução dos níveis de ocratoxina A. As enzimas peroxidases testadas foram a comercial e a obtida do farelo de arroz. Para a extração enzimática foram utilizadas as frações granulométricas do farelo de arroz de 48 a 100 mesh, sendo estas frações caracterizadas quimicamente. A peroxidase foi extraída do farelo de arroz em tampão 10 mM pH 5,0 e purificada por partição trifásica, obtendo 77,1% de recuperação e 9,2 para o fator de purificação. O método utilizado para a extração da ocratoxina A do sistema aquoso foi por partição líquido-líquido utilizando como solvente o clorofórmio, sendo esse método validado segundo os parâmetros de linearidade (0,1 a 20 ng mL-1), coeficientes de correlação (0,9997) e de determinação (0,9994), e limites de detecção (0,02) e quantificação (0,03). A afinidade entre as peroxidases e a ocratoxina A foi verificada segundo os parâmetros de KM e Vmáx, resultando em 0,00027 mM e 0,000015 mM min-1, respectivamente, para a peroxidase comercial, e 0,0065 mM e 0,000031 mM min-1 para a obtida do farelo de arroz. Com relação aos percentuais de redução de ocratoxina A, foram avaliadas 3 proporções enzima:substrato (1:10, 1:5 e 8:1 para a comercial e 1:10, 1:5 e a com atividade de 0,063 U mL-1 para a do farelo), sendo que as proporções que forneceram maior redução foi a de 8:1 para a enzima comercial (0,063 U mL-1) e a correspondente a 0,063 U mL-1 para a enzima obtida do farelo. Os percentuais de redução de ocratoxina A foram de 59% para a peroxidase comercial em 300 min e 41% para a peroxidase do farelo de arroz em 1440 min. O efeito de adsorção da ocratoxina A pela enzima peroxidase foi descartado uma vez que foi realizada a sua hidrólise com a enzima pepsina e verificado um percentual de 2,7% de adsorção, demonstrando que a redução foi por ação enzimática. A enzima obtida de farelo de arroz com atividade de 0,063 U mL-1 foi aplicada em suco de uva tinto e branco. Observou-se que para o primeiro não houve redução significativa, enquanto que para o segundo a redução foi de 17%. Neste trabalho, então, foi possível verificar a capacidade de redução dos níveis da ocratoxina A pela enzima peroxidase, tanto em sistema aquoso como no suco de uva integral branco.

Aplicação de peroxidase para degradação de deoxinivalenol

Deoxinivalenol (DON), uma das principais micotoxinas encontradas em matrizes alimentares, é um composto químico que possui em sua estrutura um anel epóxido que lhe confere alto grau de toxicidade. A aplicação de enzimas em processos de degradação de DON vem se destacando, pela estabilidade durante o processo reacional e baixo custo de produção. O objetivo desse trabalho foi estudar o potencial de peroxidase proveniente de farelo de arroz (FA) e farelo de soja (FS) para degradar DON. As condições de obtenção da PO a partir de FA foram definidas por planejamento experimental DCCR 23 , sendo extraída de 5 g de farelo com 50 mL de tampão fosfato 0,04 mol L-1 pH 5, agitados orbitalmente durante 60 min a 100 rpm, e para a PO obtida de FS as condições diferenciaram somente quanto a solução extratora, tampão fosfato 0,01 mol L-1 pH 4,7. A técnica que apresentou melhores índices de purificação para a enzima foi a partição trifásica apresentando fator de purificação e recuperação de 5,6 e 50 % para a obtida de FA e 13,61 e 50 % para FS. A PO de FA apresentou maior atividade em tampão fosfato 5 mmol L-1 pH 5,5 para as formas bruta e pura, diferindo na temperatura de reação de 25 °C e 10 °C, KM de 0,15 e 0,06 mmol L-1 e Vmáx de 769 e 667 U mg-1 , respectivamente. A PO de FS as condições foram: tampão fosfato 5 mmol L-1 pH 5, reação a 35 e 30 °C durante 10 e 5 min, KM de 0,17 e 0,05 mmol L-1 e Vmáx de 196 e 182 U mg-1 , respectivamente. A PO de FA demonstrou maior estabilidade em pH 5 enquanto que a de FS em pH 6, ambas enzimas apresentaram maior estabilidade térmica a 0 °C, as massas moleculares encontradas por eletroforese foram 41 e 34 kDa, respectivamente. Ao final das etapas de obtenção, purificação e caracterização obteve-se uma atividade específica de 116 e 794 U.mg-1 , e 4363 e 17453 U g-1 , respectivamente para PO de FA e FS. A determinação de DON e De-DON foi realizada por HPLC-DAD e LC-ESI-MS/MS para avaliação dos ensaios de degradação. A enzima comercial HRP, mostrou maior potencial de redução sobre DON (55% após 1 h de reação), no entanto em 3 h de reação, a concentração inicial da micotoxina DON foi verificada, o que evidencia que a redução pode ocorrer por adsorção ou por formação de um composto de degradação que apresente a mesma massa molecular. O emprego da enzima PO obtida de FA e FS na degradação necessita de uma avaliação cinética micotoxicologica para definição das condições de redução significativa dos níveis de DON.