Produção de biossurfactantes e nanoemulsões a partir da microalga spirulina

As microalgas têm sido foco de muitos estudos tendo em vista sua grande aplicabilidade na indústria de alimentos e farmacêutica, como também nas áreas da biomedicina e ambiental. A Spirulina é uma microalga que possui alto valor nutricional, apresenta alto teor proteico e é rica em substâncias bioativas. Esta microalga apresenta em sua composição compostos como glicolípidios, fosfolipídios e lipídios neutros, que por sua vez possuem efeito biossurfactante. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar a potencialidade de produção de biossurfactantes a partir de diferentes cepas de Spirulina. Para isso, foram realizados experimentos utilizando Delineamento Fatorial Completo 22 , visando avaliar a influência da concentração de fósforo e nitrogênio no cultivo das microalgas Spirulina platensis Paracas, Spirulina platensis LEB 52 e Spirulina sp. LEB 18, como também nos extratos oriundos das microalgas, através da medida da tensão superficial. Foi também avaliada a influência destes nutrientes em extratos de Spirulina platensis LEB 52 e Spirulina sp. LEB 18 a partir do índice de emulsificação e diâmetro médio das gotículas das emulsões preparadas a partir dos extratos. Para extrações de biossurfactantes foram testados os solventes metanol, etanol e hexano. Nas formulações das nanoemulsões utilizou-se homogeneizador de alta velocidade, como fase aquosa os extratos oriundos das microalgas e como fase oleosa, óleo de girassol. As formulações foram preparadas utilizando-se diferentes concentrações da fase aquosa e oleosa, bem como diferentes velocidades e tempos de agitação. De acordo com os cultivos de Spirulina platensis Paracas realizados foi verificado que o cultivo que atingiu maior valor de concentração máxima de biomassa e maior produtividade foi realizado com 114 mg.L-1 de fósforo e sem adição de nitrogênio. Porém em relação às microalgas Spirulina platensis LEB 52 e Spirulina sp. LEB 18, as variáveis fósforo e nitrogênio não apresentaram influência significativa na concentração máxima de biomassa e produtividade máxima. O extrato que apresentou a menor tensão superficial (26,75 mN.m-1 ) foi verificado quando foi utilizado etanol como solvente, sendo este obtido a partir de cultivo da microalga Spirulina sp. LEB 18 realizado sem adição de nitrogênio e de fósforo. Em relação ao índice de emulsificação foram atingidos valores superiores a 59%, porém as concentrações utilizadas de nitrogênio e fósforo não apresentaram influência significativa nesta resposta. Neste trabalho foi possível obter nanoemulsões estáveis por até 30 d e com diâmetro médio de gotículas de até 532 nm. Os resultados obtidos neste trabalho são favoráveis à pesquisa na aplicação tanto dos extratos microalgais como das nanoemulsões obtidas apresentando potencialidade de uso em diversos processos industriais, como nas áreas ambiental, farmacêutica, cosmética e alimentos.

Obtenção de um hidrogel proveniente de proteínas da corvina (micropogonias furnieri) e solubilização das proteínas fibrosas residuais

Com o aumento na captura de pescado e da poluição do meio ambiente, esta-se à margem de exceder a estimativa do limite da sustentabilidade, e obviamente isto faz com se utilize os recursos marítimos com mais inteligência e precaução. Aplicando tecnologia enzimática ou química é possível recuperar as proteínas do processamento do pescado, produzindo hidrolisados e isolados protéicos. Uma grande quantidade de proteínas insolúveis está disponível em escamas, peles e ossos, subprodutos do processamento do pescado, que podem ser solubilizadas através de fungos e bactérias. Utilizando isolados protéicos é possível obter biopolímeros, estes têm chamado a atenção nos últimos anos, pois são biodegradáveis, não-tóxicos e geralmente biocompatíveis. Os hidrogéis protéicos são polímeros que podem absorver uma quantidade de água a partir de 10 até centenas de vezes o seu peso seco. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um hidrogel protéico, com propriedades superabsorventes, a partir das proteínas solúveis e insolúveis da corvina (Micropogonias furnieri). Para a produção dos hidrolisados a partir das proteínas solúveis foi utilizado processo enzimático (Alcalase e Flavourzyme) e químico (solubilização ácida e alcalina). Nos processos de solubilização das proteínas insolúveis foram utilizados microrganismos (bactérias e fungos). Tanto as bactérias como os fungos avaliados apresentaram capacidade de solubilizar as proteínas insolúveis presentes nos resíduos (escamas, ossos, cartilagens e outros). A bactéria que atingiu a maior atividade proteolítica foi a Bacillus velesensis (47,56 U mL-1) e o fungo foi o Penicillium sp. (E20) (31,20 U mL-1). Para a produção dos hidrogéis, foram utilizados isolados protéicos provenientes de solubilização ácida ou alcalina, produzidos a partir de resíduos da industrialização de pescado, modificados quimicamente com dianidrido etilenodiamino tetraacético (EDTAD) e adicionados de agente de ligação cruzada (glutaraldeído). Algumas proteínas modificadas ainda foram submetidas a tratamento com etanol. Foram realizadas análise estrutural das proteínas modificadas e estudo da capacidade de retenção de água dos hidrogéis assim obtidos. Os hidrogéis produzidos apresentaram alta capacidade de retenção de água. A máxima absorção de água foi alcançada pelo hidrogel ácido sem o tratamento com etanol foi de 103,25 gágua/ggel seco, enquanto que a mesma amostra tratada com etanol alcançou 216,05 gágua/ggel seco. Os hidrogéis produzidos podem ser utilizados em diversas indústrias, tais como, farmacêutica, alimentícia, médica, agroindústria, entre outras, que necessitem de hidrogéis com alta capacidade de retenção de água.

Otimização da produção biotecnológica de lipases e correlação com a produção de biossurfactantes

As lipases e os biossurfactantes são compostos produzidos por microrganismos através de fermentações em estado sólido (FES) ou sumberso (FSm), os quais são aplicáveis nas indústrias alimentícia e farmacêutica, na bioenergia e na biorremediação, entre outras. O objetivo geral deste trabalho foi otimizar a produção de lipases através de fermentação em estado sólido e fermentação submersa. Os fungos foram selecionados quanto à habilidade de produção de lipases através de FES e FSm e aqueles que apresentaram as maiores atividades lipolíticas foram utilizados na seleção de variáveis significativas e na otimização da produção de lipases nos dois modos de cultivo. Foram empregadas técnicas seqüenciais de planejamento experimental, incluindo planejamentos fracionários, completos e a metodologia de superfície de resposta para a otimização da produção de lipases. As variáveis estudadas na FES foram o pH, o tipo de farelo como fonte de carbono, a fonte de nitrogênio, o indutor, a concentração da fonte de nitrogênio, a concentração do indutor e a cepa do fungo. Na FSm, além das variáveis estudadas na FES, estudaram-se as variáveis concentração inicial de inóculo e agitação. As enzimas produzidas foram caracterizadas quanto à temperatura e pH ótimos e quanto à estabilidade a temperatura e pH. Nas condições otimizadas de produção de lipases, foi avaliada a correlação entre a produção de lipases e bioemulsificantes. Inicialmente foram isolados 28 fungos. Os fungos Aspergillus O- 4 e Aspergillus E-6 foram selecionados como bons produtores de lipases no processo de fermentação em estado sólido e os fungos Penicillium E-3, Trichoderma E-19 e Aspergillus O-8 como bons produtores de lipases através da fermentação submersa. As condições otimizadas para a produção de lipases através de fermentação em estado sólido foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-4, farelo de soja, 2% de nitrato de sódio, 2% de azeite de oliva e pHs inferiores a 5, obtendo-se atividades lipolíticas máximas de 57 U. As condições otimizadas para a produção de lipases na fermentação submersa foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-8, farelo de trigo, 4,5% de extrato de levedura, 2% de óleo de soja e pH 7,15. A máxima atividade obtida durante a etapa de otimização foi 6 U. As lipases obtidas por FES apresentaram atividades máximas a 35ºC e pH 6,0, enquanto que as obtidas por FSm apresentaram ótimos a 37ºC e pH 7,2. A estabilidade térmica das lipases produzidas via FSm foi superior a das lipases obtidas via FES, com atividades residuais de 72% e 26,8% após 1h de exposição a 90ºC e 60ºC, respectivamente. As lipases obtidas via FES foram mais estáveis em pH´s alcalinos, com atividades residuais superiores a 60% após 24 h de exposição, enquanto as lipases produzidas via FSm foram mais estáveis em pH´s ácidos, com 80% de atividade residual na faixa de pH entre 3,5 e 6,5. Na fermentação submersa a correlação entre a produção de lipases e a atividade emulsificante óleo em água (O/A) e água em óleo (A/O) dos extratos foi 95,4% e 86,8%, respectivamente, obtendo-se atividades emulsificantes máximas O/A e A/O de 2,95 UE e 42,7 UE. Embora a maior produção de lipases tenha sido obtida na fermentação em estado sólido, não houve produção concomitante de biossurfactantes. Os extratos da fermentação submersa apresentaram redução da tensão superficial de 50 mN m -1 para 28 mN m -1 e atividade antimicrobiana frente ao microrganismo S. aureus ATCC 25923, com potenciais antimicrobianos de 36 a 43% nos três primeiros dias de fermentação. A fermentação submersa foi a técnica que apresentou os melhores resultados de otimização da produção de lipases, bem como de produção simultânea de biossurfactantes.

Purificação, modelagem e simulação da adsorção de bioprodutos por troca iônica em coluna de leito expandido

A produção de proteínas através de microrganismos tornou-se uma técnica muito importante na obtenção de compostos de interesse da indústria farmacêutica e alimentícia. Extratos brutos nos quais as proteínas são obtidas são geralmente complexos, contendo sólidos e células em suspensão. Usualmente, para uso industrial destes compostos, é necessário obtê-los puros, para garantir a sua atuação sem interferência. Um método que vem recebendo destaque especialmente nos últimos 10 anos é o uso da cromatografia de troca iônica em leito expandido, que combina em uma única etapa os passos de clarificação, concentração e purificação da molécula alvo, reduzindo assim o tempo de operação e também os custos com equipamentos para realização de cada etapa em separado. Combinado a este fato, a última década também é marcada por trabalhos que tratam da modelagem matemática do processo de adsorção de proteínas em resinas. Está técnica, além de fornecer informações importantes sobre o processo de adsorção, também é de grande valia na otimização da etapa de adsorção, uma vez que permite que simulações sejam feitas, sem a necessidade de gasto de tempo e material com experimentos em bancada, especialmente se é desejado uma ampliação de escala. Dessa forma, o objetivo desta tese foi realizar a modelagem e simulação do processo de adsorção de bioprodutos em um caldo bruto na presença de células, usando inulinase e C-ficocianina como objeto de estudo e purificar C-ficocianina utilizando resina de troca iônica em leito expandido. A presente tese foi então dividida em quatro artigos. O primeiro artigo teve como objeto de estudo a enzima inulinase, e a otimização da etapa de adsorção desta enzima em resina de troca iônica Streamline SP, em leito expandido, foi feita através da modelagem matemática e simulação das curvas de ruptura em três diferentes graus de expansão (GE). As máximas eficiências foram observadas quando utilizadas maiores concentrações de inulinase (120 a 170 U/mL), e altura de leito entre 20 e 30 cm. O grau de expansão de 3,0 vezes foi considerado o melhor, uma vez que a produtividade foi consideravelmente superior. O segundo artigo apresenta o estudo das condições de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica, onde foi verificado o efeito do pH e temperatura na adsorção e após construída a isoterma de adsorção. A isoterma de adsorção da C-ficocianina em resina Streamline Q XL feita em pH 7,5 e a 25°C (ambiente), apresentou um bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores qm (capacidade máxima de adsorção) e Kd (constante de equilíbrio) estimados pela equação linearizada da isoterma, foram de 26,7 mg/mL e 0,067mg/mL. O terceiro artigo aborda a modelagem do processo de adsorção de extrato não clarificado de C-ficocianina em resina de troca iônica Streamline Q XL em coluna de leito expandido. Três curvas de ruptura foram feitas em diferentes graus de expansão (2,0, 2,5 e 3,0). A condição de adsorção de extrato bruto não clarificado de C-ficocianina que se mostrou mais vantajosa, por apresentar maior capacidade de adsorção, é quando se alimenta o extrato até atingir 10% de saturação da resina, em grau de expansão 2,0, com uma altura inicial de leito de 30 cm. O último artigo originado nesta tese foi sobre a purificação de C-ficocianina através da cromatografia de troca iônica em leito expandido. Uma vez que a adsorção já havia sido estudada no artigo 2, o artigo 4 enfoca na otimização das condições de eluição, visando obter um produto com máxima pureza e recuperação. A pureza é dada pela razão entre a absorbância a 620 nm pela absorbância a 280 nm, e dizse que quando C-ficocianina apresenta pureza superior a 0,7 ela pode ser usada em como corante em alimentos. A avaliação das curvas de contorno indicou que a faixa de trabalho deve ser em pH ao redor de 6,5 e volumes de eluição próximos a 150 mL. Tais condições combinadas a uma etapa de pré-eluição com 0,1M de NaCl, permitiu obter C-ficocianina com pureza de 2,9, concentração 3 mg/mL, e recuperação ao redor de 70%.

Crescimento celular e produção de carotenoides pela microalga haematococcus pluvialis

O crescimento celular da microalga Haematococcus pluvialis e a bioprodução de carotenoides são influenciados pelas diferentes condições de cultivo. Dentre os corantes naturais, a astaxantina tem importante aplicação farmacêutica, cosmética e na indústria de alimentos. Este pigmento além de colorir, possui propriedades biológicas, dentre elas a atividade antioxidante. A produção de astaxantina através do cultivo de H. pluvialis pode alcançar até 4% do peso seco da microalga. O objetivo desse trabalho foi avaliar o crescimento celular, bem como a produção de carotenoides pela microalga Haematococcus pluvialis em diferentes condições de cultivo e a atividade antioxidante dos extratos carotenogênicos. Foram utilizados os meios autotróficos Blue Green-11 (BG-11), BAR (Barbera Medium) e BBM (Bold Basal Medium) e os meios mixotróficos BBM e glicose e BBM e acetato de sódio, empregando 10 ou 20% de inóculo em pHs iniciais de 6, 7 ou 8, aeração de 0,30 L.min-1 , sob iluminância de 6 Klx, 24±1ºC durante 15 dias em fotobiorreatores de 1 L. A concentração celular foi avaliada diariamente através de leitura de absorvância a 560 nm. A ruptura celular foi realizada através de 0,05 g de células secas com 2 mL de dimetilsulfóxido e a concentração de carotenoides totais determinada a partir de leitura espectrofotométrica a 474 nm. Os meios de cultivo BG-11, BBM e glicose e BBM e acetato de sódio apresentaram, respectivamente, o maior crescimento celular e produção de carotenoides totais de 0,64, 1,18 e 0,68 g.L-1 , e 3026,66, 2623,12 e 2635,38 µg.g-1 , empregando 10% de inóculo em pH inicial de 7. Com base nesses resultados, foram selecionados esses três meios para dar continuidade ao trabalho. O meio de cultivo BBM e acetato de sódio obteve o melhor valor de concentração celular máxima, com 1,29±0,07 g.L-1 e de carotenoides totais 5653,56 µg.g-1 empregando pH inicial de 7 e concentração de inóculo de 20%. Este meio foi selecionado para a realização dos cultivos com injeção de 30 % de CO2 uma vez ao dia durante 1 hora, realizados durante 22 dias, em pH inicial de 7 e 20% de inóculo, com 30% de injeção de CO2 uma vez ao dia durante 1 hora. Nestas condições o crescimento celular alcançou o máximo de 1,13 g.L-1 (10 dias), carotenoides totais específicos de 2949,91 µg.g-1 e volumétricos de 764,79 µg.g-1 .L-1 (22 dias). A capacidade antioxidante dos extratos carotenogênicos também foi avaliada pelos métodos DPPH, FRAP e ABTS, não sendo possível quantificá-la através do DPPH e FRAP. Por outro lado, utilizando o método ABTS, em 90 minutos de reação, o poder de inibição encontrado foi de 35,70 % μg-1 . Assim, a condição que mais se destaca é a utilização do meio de cultivo BBM e acetato de sódio, com pH inicial 7, com 20% de inóculo, 0,30 L.min-1 de aeração, 6 Klx e 24±1ºC, uma vez que o crescimento celular e a bioprodução de carotenoides foi significativamente superior quando comparada às demais condições estudadas. Além disso, os carotenoides produzidos pela H. pluvialis, nesta condição, apresentaram capacidade antioxidativa.

Produção e extração da enzima anidrase carbônica e de ficobiliproteínas a partir de microalgas

Muito interesse tem sido focado no potencial biotecnológico das microalgas, principalmente devido à identificação de diversas substâncias sintetizadas por estes organismos, dentre elas a anidrase carbônica e as ficobiliproteínas. A anidrase carbônica é uma metaloenzima que catalisa a hidratação reversível do CO2 em bicarbonato com alta eficiência, sendo utilizada para captação de CO2 através de sistemas biológicos. A C-ficocianina e a aloficocianina, corantes naturais, são os dois principais componentes das ficobiliproteínas em cianobactérias e apresentam diversas aplicações dentro da indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica. O objetivo principal desta tese foi avaliar a produção e a extração da anidrase carbônica e das ficobiliproteínas a partir de diferentes microalgas. Para isso, primeiramente foi realizado uma investigação da produção da anidrase carbônica pela microalga Dunaliella tertiolecta, onde foi estudada a extração da enzima e sua aplicação em sistemas de captura enzimática de CO2. Posteriormente foi avaliada a produção da enzima ao longo do cultivo de diferentes microalgas marinhas e dulcícolas (Dunaliella tertiolecta, Tetraselmis sueccica, Phaeodactylum tricornutum, Nannochloropsis oculata, Isochysis galbana, Chlorella vulgaris e Scenedesmus obliquus). A produção da enzima e de ficobiliproteínas, também, foi estudada para as cianobactérias Spirulina platensis LEB 52, Spirulina sp. LEB 18 e Synechococcus nidulans. Todos os cultivos foram acompanhados em termos de biomassa e pH. Por último, foi realizado um estudo de extração da enzima de P. tricornutum e extração conjunta da anidrase carbônica e de ficobiliproteínas da cianobactéria S. sp. LEB 18. Os cultivos foram realizados em frascos erlenmeyer contendo os meios Conway (marinhas), BG-11 (dulcícolas) e Zarrouk 20% (cianobactérias). Na avaliação da ruptura celular foram testadas as técnicas de maceração em gral e pistilo, agitação em vórtex com pérolas de vidro, sonicação com pérolas de vidro, homogeneizador ultrassônico, secagem, congelamento e descongelamento e a combinação de tratamentos. Maiores rendimentos de extração da enzima a partir da microalga D. tertiolecta foram obtidos utilizando tratamento ultrassônico, juntamente com baixas concentrações de biomassa úmida (0,1 e 0,2 g/L), e a mesma apresentou potencial para aplicação em processos de captação enzimática do CO2. Durante os cultivos, a microalga C. vulgaris se destacou como maior produtora da enzima anidrase carbônica, atingindo valores de atividade enzimática de 44,0 U/L. As cianobactérias apresentaram valores de atividade entre 41,6 e 45,9 U/L, sendo que a S. sp. LEB 18 foi a que apresentou maiores produções de C-ficocianina e aloficocianina no ponto de máxima atividade volumétrica, 65,9 e 82,2 µg/mL, respectivamente. A enzima extraída da biomassa de S. platensis LEB 52 catalisou a hidratação do CO2 que precipitou na forma de CaCO3. Maiores rendimentos de extração da enzima a partir das microalgas P. tricornutum e S. sp. LEB 18 foram obtidos utilizando homogeneizador ultrassônico, que foram 31,3 U/g e 25,5 U/g, respectivamente. A biomassa de S. sp. LEB 18, também apresentou potencial para a extração de ficobiliproteínas, obtendo- se altas concentrações de C-ficocianina (100,5 mg/g) e aloficocianina (69,9 mg/g). Através dos resultados obtidos, pode-se verificar a potencialidade das microalgas e das cianobactérias para produção da enzima anidrase carbônica e das ficobiliproteínas, biomoléculas de alto valor industrial. Este trabalho apresenta processos eficientes para a extração da enzima e de ficobiliproteínas tanto para escala laboratorial como industrial.

Purificação de C-ficocianina e sua incorporação em nanofibras

C-ficocianina (C-FC) é uma ficobiliproteína, de cor natural azul, com diversas aplicações na indústria alimentícia, farmacêutica e biomédica, dependendo do seu grau específico de pureza, que pode variar de 0,7 a 4,0, com respectivo aumento de seu valor comercial. Essa pureza é alcançada através de diversas técnicas de purificação, que podem ser aplicadas em diferentes sequências. Um destes processos de purificação de proteínas baseia-se na cromatografia de troca iônica, que utiliza trocadores que adsorvem as proteínas como resultado de interações iônicas entre a superfície da proteína e o trocador. Resinas e colunas de leito expandido podem ser utilizadas para aumentar a produtividade dessa técnica. É fundamental conhecer o perfil do processo de adsorção, para melhor aplicá-lo como ferramenta para o design e otimização de parâmetros operacionais. Outra tecnologia para o tratamento de biomoléculas é a ultrafiltração. Esta técnica é aplicável em larga escala, apresenta baixa complexidade de aplicação e pode ser realizada em condições brandas, minimizando o dano para o produto. Para aumentar a estabilidade da C-FC, e facilitar a sua aplicação, podem ser avaliadas técnicas recentes, não exploradas para este fim, como as nanofibras obtidas através do processo de electrospinning. Estas fibras possuem uma área superficial específica extremamente elevada devido a seu pequeno diâmetro. O objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros de adsorção e diferentes técnicas para purificação de C-ficocianina de Spirulina platensis e obter nanofibras poliméricas incorporadas de C-ficocianina. O trabalho foi dividido em quatro artigos. No primeiro artigo, foram avaliados os parâmetros e as isotermas de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica para leito expandido Streamline® DEAE. Verificou-se que o maior coeficiente de partição foi obtido em pH 7,5, nas temperaturas de 15 e 25 °C. As isotermas de adsorção da Cficocianina foram bem representadas pelos modelos de Langmuir, de Freundlich e de Langmuir-Freundlich, sendo os valores estimados para Qm e Kd obtidos pela isoterma de Langmuir foram, respectivamente, 33,92 mg.mL-1 e 0,123 mg.mL-1, respectivamente. No segundo artigo foi avaliada a purificação de C-FC até grau alimentar, utilizando ultrafiltração (UF). Com a membrana de 50 kDa, identificou-se que somente a temperatura e a aplicação de diferentes ciclos de diafiltração (DF) causaram influência significativa sobre a purificação e recuperação da C-ficocianina. Foram então aplicados o aumento gradativo da quantidade de ciclos, e a diafiltração previamente à ultrafiltração (DF/UF), onde obteve-se um extrato de Cficocianina com pureza de 0,95. No terceiro artigo foram propostos processos de purificação, envolvendo a utilização das diferentes técnicas para obtenção de C-FC com diferentes purezas. Determinou-se que a partir de cromatografia de troca iônica em leito fixo seguido de DF/UF, obtém-se C-FC para uso em cosméticos e a partir de precipitação com sulfato de amônio, e DF/UF obtém-se C-FC para uso em biomarcadores. Com uma sequência de precipitação com sulfato de amônio, DF/UF e cromatografia de troca iônica em leito fixo chega-se a C-FC de grau analítico. No último artigo, C-FC foi incorporada a nanofibras de óxido de polietileno (PEO) através de processo de electrospinning. Foram determinadas a condutividade da solução de C-FC/PEO, a estrutura e comportamento termogravimétrico das nanofibras formadas. Soluções de polímeros com concentração de 6 e 8% proporcionaram a formação de nanofibras com diâmetro médio inferior a 800 nm, homogêneas, sem a presença de gotas. A análise termogravimétrica identificou aumento na resistência térmica da C-FC incorporada nas fibras.