Biodegradação de deoxinivalenol por aspergillus oryzae e rhizopus sp.: um estudo bioquímico de degradação e toxicidade

A contaminação aleatória de alimentos por micotoxinas afeta as condições de sanidade das dietas de humanos e animais. Dentre as toxinas fúngicas, deoxinivalenol (DON) se destaca pela freqüente contaminação de produtos agrícolas e alimentos e pela sua resistência a degradação pelo emprego de métodos tradicionais de processamento, o que motiva políticas de controle e a busca por técnicas de descontaminação. A descontaminação biológica empregando processsos fermentativos tem sido apontada como uma alternativa promissora, pois permite degradar micotoxinas através do sistema enzimático microbiano e melhorar características funcionais e sensoriais de matérias-primas e insumos alimentícios. Este trabalho teve por objetivo estudar condições e mecanismos de biodegradação de deoxinivalenol empregando Aspergillus oryzae e Rhizopus sp. em sistemas fermentativos submersos. Para tanto, foi necessário adequar metodologia para reação de derivação na determinação cromatográfica de DON; estudar o potencial e condições de degradação via fermentação submersa por Aspergillus oryzae e Rhizopus sp.; e avaliar a atividade de oxidoredutases e a citotoxicidade dos extratos fementados. A otimização da metodologia estabeleceu a melhor condição para a reação de derivação com 200 µL de anidrido trifluoroacético e 18 mg de bicarbonato de sódio, durante 6 minutos a 74 °C na faixa entre 7 e 21 µg de DON. A quantificação de DON residual no meio fermentado mostrou que as espécies fúngicas Rhizopus sp. e Aspergillus oryzae possuem a capacidade de degradar DON demonstrando índices médios de 87,4 e 62,4% respectivamente, principalmente quando o meio submerso foi água estéril e fermentação realizada durante 48 horas. A velocidade máxima de degradação neste intervalo foi de 10,8 e 12,4 ppb/h, observando também um aumento na atividade específica da enzima peroxidase. Os extratos dos fermentados com A. oryzae e Rhizopus sp. apresentaram efeito de inibição de proliferação celular (IC50) quando concentrados 10 vezes em 48 e 72 horas respectivamente. Os meios fermentados com Rhizopus sp. apresentaram menor efeito (1,5 vezes) quando comparado com Aspergillus oryzae.

Otimização da produção biotecnológica de lipases e correlação com a produção de biossurfactantes

As lipases e os biossurfactantes são compostos produzidos por microrganismos através de fermentações em estado sólido (FES) ou sumberso (FSm), os quais são aplicáveis nas indústrias alimentícia e farmacêutica, na bioenergia e na biorremediação, entre outras. O objetivo geral deste trabalho foi otimizar a produção de lipases através de fermentação em estado sólido e fermentação submersa. Os fungos foram selecionados quanto à habilidade de produção de lipases através de FES e FSm e aqueles que apresentaram as maiores atividades lipolíticas foram utilizados na seleção de variáveis significativas e na otimização da produção de lipases nos dois modos de cultivo. Foram empregadas técnicas seqüenciais de planejamento experimental, incluindo planejamentos fracionários, completos e a metodologia de superfície de resposta para a otimização da produção de lipases. As variáveis estudadas na FES foram o pH, o tipo de farelo como fonte de carbono, a fonte de nitrogênio, o indutor, a concentração da fonte de nitrogênio, a concentração do indutor e a cepa do fungo. Na FSm, além das variáveis estudadas na FES, estudaram-se as variáveis concentração inicial de inóculo e agitação. As enzimas produzidas foram caracterizadas quanto à temperatura e pH ótimos e quanto à estabilidade a temperatura e pH. Nas condições otimizadas de produção de lipases, foi avaliada a correlação entre a produção de lipases e bioemulsificantes. Inicialmente foram isolados 28 fungos. Os fungos Aspergillus O- 4 e Aspergillus E-6 foram selecionados como bons produtores de lipases no processo de fermentação em estado sólido e os fungos Penicillium E-3, Trichoderma E-19 e Aspergillus O-8 como bons produtores de lipases através da fermentação submersa. As condições otimizadas para a produção de lipases através de fermentação em estado sólido foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-4, farelo de soja, 2% de nitrato de sódio, 2% de azeite de oliva e pHs inferiores a 5, obtendo-se atividades lipolíticas máximas de 57 U. As condições otimizadas para a produção de lipases na fermentação submersa foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-8, farelo de trigo, 4,5% de extrato de levedura, 2% de óleo de soja e pH 7,15. A máxima atividade obtida durante a etapa de otimização foi 6 U. As lipases obtidas por FES apresentaram atividades máximas a 35ºC e pH 6,0, enquanto que as obtidas por FSm apresentaram ótimos a 37ºC e pH 7,2. A estabilidade térmica das lipases produzidas via FSm foi superior a das lipases obtidas via FES, com atividades residuais de 72% e 26,8% após 1h de exposição a 90ºC e 60ºC, respectivamente. As lipases obtidas via FES foram mais estáveis em pH´s alcalinos, com atividades residuais superiores a 60% após 24 h de exposição, enquanto as lipases produzidas via FSm foram mais estáveis em pH´s ácidos, com 80% de atividade residual na faixa de pH entre 3,5 e 6,5. Na fermentação submersa a correlação entre a produção de lipases e a atividade emulsificante óleo em água (O/A) e água em óleo (A/O) dos extratos foi 95,4% e 86,8%, respectivamente, obtendo-se atividades emulsificantes máximas O/A e A/O de 2,95 UE e 42,7 UE. Embora a maior produção de lipases tenha sido obtida na fermentação em estado sólido, não houve produção concomitante de biossurfactantes. Os extratos da fermentação submersa apresentaram redução da tensão superficial de 50 mN m -1 para 28 mN m -1 e atividade antimicrobiana frente ao microrganismo S. aureus ATCC 25923, com potenciais antimicrobianos de 36 a 43% nos três primeiros dias de fermentação. A fermentação submersa foi a técnica que apresentou os melhores resultados de otimização da produção de lipases, bem como de produção simultânea de biossurfactantes.

Redução dos níveis de Ocratoxina A por ação da enzima peroxidase

A ocratoxina A é um composto formado a partir do metabolismo secundário de fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. Uma vez que a presença dessa micotoxina nos alimentos causa sérios danos à saúde humana e animal, surge o interesse pelo desenvolvimento de métodos que visem a redução dos seus níveis em diferentes matrizes. Diversos processos de descontaminação têm sido propostos, sendo que os métodos de redução biológica tem recebido destaque. Esses métodos consistem na aplicação de micro-organismos ou de suas enzimas, o que gera a biotransformação ou degradação da toxina produzindo metabólitos com menor ou nenhuma toxicidade. Diante disso, o objetivo geral do trabalho foi avaliar o efeito da peroxidase na redução dos níveis de ocratoxina A. As enzimas peroxidases testadas foram a comercial e a obtida do farelo de arroz. Para a extração enzimática foram utilizadas as frações granulométricas do farelo de arroz de 48 a 100 mesh, sendo estas frações caracterizadas quimicamente. A peroxidase foi extraída do farelo de arroz em tampão 10 mM pH 5,0 e purificada por partição trifásica, obtendo 77,1% de recuperação e 9,2 para o fator de purificação. O método utilizado para a extração da ocratoxina A do sistema aquoso foi por partição líquido-líquido utilizando como solvente o clorofórmio, sendo esse método validado segundo os parâmetros de linearidade (0,1 a 20 ng mL-1), coeficientes de correlação (0,9997) e de determinação (0,9994), e limites de detecção (0,02) e quantificação (0,03). A afinidade entre as peroxidases e a ocratoxina A foi verificada segundo os parâmetros de KM e Vmáx, resultando em 0,00027 mM e 0,000015 mM min-1, respectivamente, para a peroxidase comercial, e 0,0065 mM e 0,000031 mM min-1 para a obtida do farelo de arroz. Com relação aos percentuais de redução de ocratoxina A, foram avaliadas 3 proporções enzima:substrato (1:10, 1:5 e 8:1 para a comercial e 1:10, 1:5 e a com atividade de 0,063 U mL-1 para a do farelo), sendo que as proporções que forneceram maior redução foi a de 8:1 para a enzima comercial (0,063 U mL-1) e a correspondente a 0,063 U mL-1 para a enzima obtida do farelo. Os percentuais de redução de ocratoxina A foram de 59% para a peroxidase comercial em 300 min e 41% para a peroxidase do farelo de arroz em 1440 min. O efeito de adsorção da ocratoxina A pela enzima peroxidase foi descartado uma vez que foi realizada a sua hidrólise com a enzima pepsina e verificado um percentual de 2,7% de adsorção, demonstrando que a redução foi por ação enzimática. A enzima obtida de farelo de arroz com atividade de 0,063 U mL-1 foi aplicada em suco de uva tinto e branco. Observou-se que para o primeiro não houve redução significativa, enquanto que para o segundo a redução foi de 17%. Neste trabalho, então, foi possível verificar a capacidade de redução dos níveis da ocratoxina A pela enzima peroxidase, tanto em sistema aquoso como no suco de uva integral branco.

Feijões: características químicas e ocorrência de aflatoxinas

As leguminosas, como o feijão, são consideradas importantes fontes de nutrientes para humanos e a contaminação por fungos e consequente produção de micotoxinas pode estar diretamente influenciada pela sua composição química. Alguns compostos estão associados aos mecanismos de defesa das leguminosas atuando como inibidores de enzimas digestivas ou barreiras físicas à patógenos. É o caso dos compostos fenólicos (CF) e algumas estruturas de caráter proteico. O objetivo deste estudo foi verificar a susceptibilidade de feijões à contaminação por aflatoxinas (AFLAs), através da avaliação da presença de compostos inibidores de enzimas fúngicas. Foi realizada a validação de um método para determinação de AFLAs em feijão. Os CF livres (solúveis em metanol), conjugados (solúveis em etanol) e ligados, bem como as diferentes frações proteicas (albumina, globulina, glutelina e prolamina) foram determinadas em 10 amostras de feijão pertencentes às espécies Phaseolus vulgaris, Vigna unguiculata e Vigna angularis. O seu potencial como inibidor de α-amilase foi testado nos extratos fenólicos e protéicos. Os feijões vermelho e carioca apresentaram os maiores teores de CF totais (1766 µg.g -1 e 1190 µg.g -1 , respectivamente) e os feijões fradinho e branco os menores teores (183 µg.g -1 e 192 µg.g -1 ). Os extratos de CF conjugados apresentaram os teores mais elevados de AF, onde os feijões amendoim se destacou pela maior concentração (68 µg.g -1 ) e o feijão azuki pelo menor (28 µg.g -1 ). Nos extratos de CF livres e conjugados, o ácido clorogênico foi o majoritário em 60% dos feijões analisados e nos extratos de CF ligados, o ácido ferúlico foi o majoritário em 90% dos feijões analisados. Com relação às frações proteicas solúveis, o feijão carioca apresentou o maior teor de albumina (559 mg.g -1 ), globulina (164 mg.g -1 ) e glutelina (325 mg.g -1 ). Com relação à fração prolamina, o feijão preto (brasileiro e chinês) apresentou o maior teor (64 e 65 mg.g -1 , respectivamente), seguido pelo feijão carioca (54 mg.g -1 ). Os limites de detecção (LDm) obtidos para o método de determinação de AFLAs foram de 2,4 µg.kg-1 ; 0,036 µg.kg-1 e 0,06 µg.kg-1 para as AFLAs B1, B2 e G2 e os limites de quantificação (LQm) foram de 4,8 µg.kg-1 (AFLAB1); 0,12 µg.kg- 1 (AFLA B2 e G2). Não foram detectadas AFLAs B1, B2, G1 e G2 nos feijões analisados. Os CF dos extratos etanólicos dos feijões amendoim e azuki e os extratos contendo as proteínas solúveis em etanol dos feijões carioca e fradinho foram testados quanto ao seu potencial para inibição da α-amilase de Aspergillus oryzae (atividade de 4,8 mg amido hidrolisado.mg proteína-1 .mL-1 ). O extrato proteico do feijão fradinho se destacou, pois atingiu um percentual de inibição específica de aproximadamente 56%. Os CF apresentaram uma tendência à inibição incompetitiva e os extratos proteicos não apresentaram um comportamento de inibição que permitisse definir o mecanismo de inibição. Os extratos protéicos e fenólicos dos feijões mostraram ser capazes de inibir a amilase fúngica sugerindo que este fato pode estar associado a ausência da presença de AFLAs nas amostras analisadas.

Potencial antifúngico, antioxidante e inibidor da produção de aflatoxina por extratos fenólicos de Chlorella sp. e Spirulina platensis

A contaminação fúngica acarreta alterações na qualidade nutricional e no valor econômico de produtos alimentícios podendo causar danos patológicos em plantas, animais e humanos. A identificação da atividade antioxidante, antifúngica e antimicotoxinas, em extratos de microalgas com propriedade de inibir a multiplicação de fungos e subseqüente produção de micotoxinas abre a perspectiva de empregar substâncias mais eficientes e com maior ação específica contra estes microorganismos. Entre os compostos com propriedades inibidoras de radicais livres, de crescimento fúngico e produção de micotoxinas, destacam-se os compostos fenólicos, que podem inibir a atividade metabólica microbiana, dificultando a atividade de enzimas. Neste estudo foram avaliados o poder de inibição de multiplicação fúngica de Rhizopus oryzae e Aspergillus flavus pelos extratos fenólicos de Chlorella sp. e Spirulina platensis, bem como sua atividade antioxidante, e a atividade antimicotoxinas da última microalga contra Aspergillus flavus. O conteúdo de fenóis totais foi em média 1000 µgfenóis/g Spirulina platensis e 600 µgfenóis/g Chlorella sp., sendo que o acido gálico e o cafeíco foram identificados como compostos majoritários na Spirulina platensis. As determinações de glicosamina (parede celular) e ergosterol (membrana celular) mostraram-se bons indicativos do desenvolvimento microbiano permitindo uma boa estimativa da inibição dele. O extrato fenólico de Spirulina platensis apresentou capacidade de inibir cerca de 50% a formação da parede e da membrana celular para ambos os fungos estudados e de 100% a produção de aflatoxina B1 até o 10º dia de cultivo do Aspergillus flavus. Além disso, o extrato metanólico de Spirulina platensis inativou 53,5% o DPPH reativo, limitou o escurecimento enzimático ocasionado pela peroxidase em 55% e inibiu a peroxidação lipídica em 46% após 14 dias de armazenamento sob luz. Estes resultados mostram que a ação antifúngica, antimicotoxinas e antioxidante está naturalmente presente em alguns tecidos microbianos e que encontrar a forma de extraí-los e aplicá-los como conservantes alimentícios é muito promissor para substituição aos antifúngicos e outros conservantes químicos.

Conversão da lactose e síntese de galacto-oligossacarídeos: uma abordagem experimental e teórica

O presente trabalho avaliou, na etapa experimental, um processo simultâneo de catálise e fermentação láctica visando obter um iogurte com potenciais características nutracêuticas e, na sua etapa teórica, estabeleceu uma interlocução entre a vivência experimentalista e a teoria da cinética enzimática, no que se refere à conversão da lactose e à síntese de galactooligossacarídeos (GOS). Na abordagem experimental, para um substrato específico, avaliouse biocatálise conduzida simultaneamente à fermentação, defasando a adição da enzima em relação ao início do processo fermentativo. A fermentação foi realizada a partir de cultura láctica liofilizada comercial contendo dois micro-organismos probióticos, Bifidobacterium animalis e Lactobacillus acidophilus, associados aos micro-organismos característicos do iogurte, Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus. Foi utilizado um preparado enzimático contendo -galactosidases obtidas de duas origens distintas: Kluyveromyces lactis e Aspergillus niger. Foram avaliados os efeitos da concentração da enzima e do tempo de adição da enzima em um planejamento experimental 2 2 . As respostas foram às concentrações, ao final do processo, de lactose, de GOS, de glicose e de galactose e a hidrólise dos galactooligossacarídeos ao longo do tempo. No que se refere à abordagem teórica, o presente trabalho considerou modelos matemáticos de hidrólise de dissacarídeos e conversão da lactose, em que a inibição foi representada a partir do incremento da concentração dos produtos da reação. No que se refere à conversão da lactose e síntese de GOS, o presente trabalho buscou estabelecer um modelo matemático em que a inibição ocorreu por efeito do incremento das concentrações de glicose e de galactose, comparando-o com os modelos conhecidos na literatura. Verificou-se que o desempenho do modelo obtido no presente trabalho foi robusto em relação às premissas estabelecidas. Na comparação com resultados experimentais de conversão enzimática, o modelo mostrou-se capaz de minimizar o erro e de ajustar-se aos dados experimentais.