Avaliação transcricional de Glutationas -transferases em PEIXE-ZEBRA (Danio rerio) e alterações causadas pela exposição á Microcistina-LR

As Microcistinas são heptapeptídios cíclicos produzidos como metabólitos secundários por diferentes espécies de cianobactérias, sendo relevantes pelo seu potencial hepatotóxico. Peixes apresentam estratégias bioquímicas para detoxificar contaminantes ambientais, incluindo a ativação de enzimas de fase II de biotransformação, que incluem as isoformas de glutationa S-transferase (GST). As GST catalizam a conjugação de glutationa reduzida (GSH) com uma variedade de xenobióticos, incluindo as microcistinas. O presente estudo avaliou os níveis transcricionais de quinze isoformas de GST a fim de identificar isoformas possivelmente envolvidas na detoxificação de contaminantes ambientais como a microcistina-LR (MC-LR) em Danio rerio. A técnica de PCR em tempo real (RT-qPCR) foi utilizada para avaliação dos níveis transcricionais, permitindo análise das GST em diferentes órgãos, abundância e a ativação/repressão das isoformas de GST pela exposição à MC-LR. Foram avaliados os possíveis efeitos causados em brânquia e fígado após exposição por 24 hs às concentrações de 5 µg.L-1 e 50 µg.L-1 de MC-LR. Baseado nos scores de estabilidade para oito genes normalizadores, foram selecionados glicose-6-fosfato desidrogenase (g6pdh), β-actina1 e beta-2-microglobulina (b2m); b2m, alfa-tubulina 1 (tuba) e β- actin1; e tuba, b2m e g6pdh, para normalização dos níveis trancricionais de GST para distribuição órgão-específica, abundância e efeito da MC-LR em brânquia e fígado, respectivamente. A avaliação transcricional da distribuição órgão-específica revelou níveis significativos de gstal e gstk1.1 no fígado; gstp1 e gstp2 em brânquia; mgst3a, gstr1, gstm2, gstm33, gstp1, gstp2 e gstk1.1 no intestino; gstm2, gstm3 e gstal no olho e gstt1a e gsta2.1 no cérebro. Considerando os níveis de transcritos para um dado órgão, gstk1.1, gstal, gstp1 e gstt2 foram mais abundantes nos órgãos de detoxificação, tais como o fígado, brânquias e intestino, enquanto gstt1a e gsta2.1 foram mais abundantes no rim. Em brânquia, gsta2.1 e gstt1b foram reprimidas por 5 µg.L-1 de MC-LR e mgst1.1 foi reprimida em 50 µg.L-1 de MC-LR. No fígado, as isoformas gst2.2 e gstp2 foram reprimidas em ambas as concentrações, gstal foi reprimida em 5 µg.L-1, e gstt1a e gstk1.1 foram reprimidas em 50 µg.L-1 de MC-LR. As isoformas gstal, gstr1, gstp1, mgst3a, gstm1, gstm2 e gstm3 não foram alteradas pela exposição a MC-LR. Os resultados obtidos fornecem informações para a escolha de isoformas específicas de GST possivelmente envolvidas na detoxificação/toxicidade de MC-LR, a serem melhores caracterizadas ao nível protéico e também contribui para a escolha de genes normalizadores a serem utilizados em outros estudos da mesma natureza

Atividade colinesterásica no monitoramento ambiental: importância da determinação de parâmetros cinéticos em peixes estuarinos

Neste trabalho foram analisados os parâmetros cinéticos e a atividade colinesterásica de duas espécies de peixes estuarinos: a corvina Micropogonias furnieri (Teleostei, Scianidae) e o bagre Cathorops spixii (Teleostei, Ariidae), buscando avaliar o uso destas espécies como bioindicadores da presença de compostos anticolinesterásicos no meio aquático. Os exemplares de corvina e bagre, respectivamente, foram coletados nos estados do RS (Lagoa dos Patos) e PR (Baía de Paranaguá) no inverno (corvina) e verão (corvina e bagre) em dois pontos de coleta: um local controle e outro poluído. Os peixes foram anestesiados (bezocaína, 200 ppm) e os cérebros dissecados, homogeneizados e centrifugados. Foram estimados os parâmetros cinéticos (Vmax e Kmap), utilizando iodeto de acetiltiocolina como substrato, nas seguintes concentrações: 0,025; 0,05; 0,2; 0,8; 1,6; 3,2 e 9 mM. Nos estudos de inibição enzimática foi utilizado o carbamato eserina em concentrações de 0,3 a 10 mM e de 1x10-4 a 1 µM, a fim de determinar os parâmetros cinéticos de inibição e a concentração de eserina que inibia 50% da atividade colinesterásica (CI50), respectivamente. Os resultados mostraram pouca variação nos valores de Kmap nas duas espécies, porém diferenças significativas nos valores de CI50 foram observadas, indicando que a ChE do cérebro da corvina M. furnieri é resistente à inibição por eserina. Nos estudos de cinética de inibição da ChE do cérebro do bagre C. spixii, foram encontradas diferenças entre alguns parâmetros, quando foram comparados os peixes coletados no local controle com aqueles coletados no local poluído. Houve uma maior atividade colinesterásica de bagres coletados no local poluído (p<0,05), sendo que o mesmo resultado foi observado em exemplares de corvinas M. furnieri coletados durante o inverno no local poluído. Os resultados obtidos in vitro demonstram que a ChE de M. furnieri possui pouca sensibilidade à eserina. 5 Porém, o fato de ter sido registrada inibição colinesterásica nos organismos coletados durante o verão região poluída sugere a possibilidade de alterações significativas na capacidade de bio-oxidação de pesticidas nesta espécie, ou a possibilidade de inibição por outros contaminantes que também afetam a atividade colinesterásica, como por exemplo, metais. No caso de C. spixii, a determinação dos parâmetros cinéticos e de atividade colinesterásica sugere que pode estar ocorrendo alterações bioquímicas nos peixes previamente expostos a contaminantes no ambiente, provavelmente devido a respostas adaptativas ao ambiente impactado. Desta forma, o presente estudo indica a importância de estudos cinéticos prévios, quando se utiliza ou pretende utilizar, a atividade colinesterásica como bioindicador da presença de compostos anticolinesterásicos no ambiente em espécies aquáticas.