Understanding the role of auxins and oxidative enzymes on adventitious root formation in olive (olea europaea L.) cultivars

Olive (Olea europaea L.), one of the main crops in the Mediterranean basin, is mainly propagated by cuttings, a classical propagation method that relies on the ability of the cuttings to form adventitious roots. While some cultivars are easily propagated by this technique, some of the most interesting olive cultivars are considered difficult-to-root which poses a challenge for their preservation and commercialization. Therefore, increasing the current knowledge on adventitious root formation is extremely important for species like olive. This research focuses on evaluating the role of free auxins and oxidative enzymes on adventitious root formation of two olive cultivars with different rooting ability - ‘Galega vulgar’ (difficult-to-root) and ‘Cobrançosa’ (easy-to-root). In this context, free auxin levels and enzyme activities were determined in in vitro-cultured ‘Galega vulgar’ microshoots and in semi-hardwood cuttings of cvs. ‘Galega vulgar’ and ‘Cobrançosa’. To attain this goal, an analytical method for the quantification of free indole-3-acetic acid (IAA) and indole-3-butyric acid (IBA) was developed, which is based on dispersive liquid-liquid microextraction followed by microwave derivatization (DLLME-MAD) and gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. The developed method was validated in terms of linearity, recovery, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) and proved to be useful in the analysis of two very different types of plant tissues. The results from auxin quantification in olive samples point at a relationship between free auxin levels and rooting ability of both microshoots and semihardwood cuttings. A defective IBA-IAA conversion, resulting in a peak of free IAA during initiation phase, seems to be associated with low rooting ability. Likewise, differences in the activity of oxidative enzymes also appear to be related with rooting ability. Higher polyphenol oxidases (PPO) activity is likely related with an easyto- root behavior, while the opposite is true for peroxidases (POX) (including IAA oxidase (IAAox)) activity. A possible hypothesis for adventitious root formation in olive microcuttings is presented herein for the first time. Free auxins, oxidative enzymes, alternative oxidase (AOX) and reactive oxygen species (ROS) are some of the factors that may be involved in this highly complex physiological process. Interestingly, while temporal changes in auxin levels were similar between microshoots and semihardwood cuttings, the conclusions obtained from enzyme activity results in microshoots didn’t translate to semi-hardwood tissues, showing the emerging need for adaptation of classical agronomical research studies to modern techniques; Resumo: Procurando compreender o papel das auxinas e enzimas oxidativas na formação de raízes adventícias em cultivares de oliveira (Olea europaea L.) A oliveira (Olea europaea L.) é uma das principais culturas da bacia Mediterrânica e é propagada maioritariamente por estacaria, um processo altamente dependente da capacidade das estacas para formar raízes adventícias. Enquanto algumas cultivares são fáceis de propagar desta forma, algumas das cultivares de oliveira mais interessantes são consideradas difíceis de enraizar, o que dificulta a sua preservação e comercialização e torna extremamente importante aprofundar o conhecimento sobre o enraizamento adventício desta espécie. Este trabalho foca-se na avaliação do papel das auxinas livres e das enzimas oxidativas na formação de raízes adventícias em duas cultivares de oliveira com diferente capacidade de enraizamento - ‘Galega vulgar’ (difícil de enraizar) e ‘Cobrançosa’ (fácil de enraizar). Neste contexto, determinaram-se os níveis de auxinas livres e as actividades de enzimas oxidativas em microestacas de ‘Galega vulgar’ cultivadas in vitro bem como em estacas semi-lenhosas das cvs. ‘Galega vulgar’ e ‘Cobrançosa’. Para tal foi necessário desenvolver uma metodologia analítica para a quantificação de ácido indol-3-acético (IAA) e ácido indol-3-butírico (IBA), baseada em microextracção dispersiva líquido-líquido (DLLME) seguida de derivatização em microondas (MAD) e análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC/MS). O método desenvolvido foi validado em termos de linearidade, recuperação, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ), e mostrou-se eficaz na análise de dois tipos de tecidos vegetais bastante diferentes. Os resultados da análise de auxinas em amostras de oliveira apontam para uma possível relação entre os níveis de auxinas livres e a capacidade de enraizamento, tanto em microestacas como em estacas semi-lenhosas. Uma conversão IBA-IAA deficiente, que resulta num pico de IAA durante a fase de iniciação, parece estar associada à baixa capacidade de enraizamento. Por outro lado, a capacidade de enraizamento também parece estar relacionada com diferenças na actividade de enzimas oxidativas. Comportamentos fáceis de enraizar estão associados a actividade mais elevada das polifenoloxidases (PPO), enquanto o oposto é verdade para a actividade das peroxidases (POX) (incluindo a IAA oxidase (IAAox)). Neste trabalho propõe-se pela primeira vez uma possível explicação para o enraizamento adventício em microestacas de oliveira. Auxinas livres, enzimas oxidativas, oxidase alternativa (AOX) e espécies reactivas de oxigénio (ROS) são alguns dos factores envolvidos neste processo fisiológico altamente complexo. Curiosamente, enquanto as alterações temporais nos níveis de auxinas foram semelhantes entre microestacas e estacas semi-lenhosas, o mesmo não se observou relativamente à actividade enzimática, o que mostra a necessidade de adaptação dos estudos agronómicos tradicionais às técnicas correntes.

On the brink of madness: Leituras do tema da loucura na obra pré-heteronímica de Fernando Pessoa

O tema da loucura na obra pessoana tem sido objecto de várias aproximações interpretativas, decorrentes da multiplicidade de textos que fazem eco do fenómeno e da sua persistência enquanto topos ao longo de praticamente toda a sua produção. Na sua acepção literal, manteve constantes interferências com a dimensão empírica do autor sobretudo quando sustentadas na contingência de certos textos basilares, os quais têm vindo a ser questionados quanto ao seu valor estritamente testemunhal. Como fenómeno desde cedo relacionado com a criação artística, a loucura surge neste estudo não apenas na representatividade da condição distintiva do sujeito criador mas ainda como figuração da contingência que envolve qualquer acto criativo que tome a linguagem na sua dimensão essencialmente metafórica e ambígua. Neste sentido, o presente trabalho pretende a abertura de várias vias de leitura do fenómeno através da análise crítica dos vocabulários relativos a diferentes âmbitos e concepções de loucura e a sua relação com o génio (capítulos I e II), focando o seu interesse no que diz respeito a alguma produção pessoana pré-heteronímica, nomeadamente Charles Robert Anon, Alexander Search (capítulo III) e Jean Seul de Méluret (capítulo IV), a que acrescentaremos o Primeiro Fausto (capítulo IV), de modo a conseguirmos estabelecer uma possível relação entre as primeiras experiências de alterização e a descoberta simultânea da irredutibilidade do discurso literário face a tentativas de literalização e de racionalização da linguagem, defendidas por outros modelos (paradigma biologista). A identificação da ambiguidade e da ironia nas suas mais variadas acepções como componentes essenciais da aprendizagem do valor contingente do processo de criação contribuirá tanto para a definição da autonomização da literatura como para a redescrição moderna do sujeito criador, paradoxalmente investido do pathos criativo anunciado no Romantismo e confrontando-se com os seus limites, que corresponderão aos da própria linguagem, situação de crise de que a figuração do louco lúcido será um dos tópicos mais produtivos. ABSTRACT: The theme of madness in the Pessoa work has been the subject of several interpretive approaches, from the multiplicity of texts that echo the phenomenon and its persistence as a topos priority over virtually all its production. ln its physiological sense, remained constant interference with the empirical dimension of the author when sustained in the contingency of certain basic texts that have been questioned as to their strictly testimonial value. As early phenomenon associated with artistic creation, the madness in this study is not only representative in the distinctive condition of the subject creator but also as the contingency figuration involving any creative act to take the language mainly in its essential metaphorical and ambiguous dimension. Accordingly, this work intends to open several analysis manners of the phenomenon through critical analysis of vocabularies for different areas and concepts of madness and its special relationship with the genius (Chapters I and II), focusing its interest in respect to some of the previous-heteronomy Pessoa production, including Charles Robert Anon, Alexander Search (Chapter III) and Jean Seul de Méluret (Chapter IV), and the Primeiro Fausto (Chapter IV), among others, to establish a possible relationship between changing early experiences and the discovery simultaneous literary discourse of irreducibility in the face of the attempts of literacy and the rationalization of language defended by other models (biologist paradigm). The identification of the ambiguity and irony in its many different meanings as essential components of learning the contingent value of the creation process which will contribute to the definition of empowerment in the literature as to the redescription of the modem subject creator that paradoxically had the creative pathos announced in Romanticism and from the confrontation with its limits, which will correspond to the language itself, the crisis situation from which the mad-lucid figuration will be one of the most productive topics.

Quantification of free auxins in semi-hardwood plant cuttings and microshoots by dispersive liquid–liquid microextraction/microwave derivatization and GC/MS analysis

Several studies have suggested that differences in the natural rooting ability of plant cuttings could be attributed to differences in endogenous auxin levels. Hence, during rooting experiments, it is important to be able to routinely monitor the evolution of endogenous levels of plant hormones. This work reports the development of a new method for the quantification of free auxins in auxin-treated Olea europaea (L.) explants, using dispersive liquid–liquid microextraction (DLLME) and microwave assisted derivatization (MAD) followed by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis. Linear ranges of 0.5–500 ng mL 1 and 1–500 mg mL 1 were used for the quantification of indole-3-acetic acid (IAA) and indole-3-butyric acid (IBA), respectively. Determined by serial dilutions, the limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were 0.05 ng mL 1 and 0.25 ng mL 1, respectively for both compounds. When using the calibration curve for determination, the LOQ corresponded to 0.5 ng mL 1 (IAA) and 0.5 mg mL 1 (IBA). The proposed method proved to be substantially faster than other alternatives, and allowed free auxin quantification in real samples of semi-hardwood cuttings and microshoots of two olive cultivars. The concentrations found in the analyzed samples are in the range of 0.131–0.342 mg g 1 (IAA) and 20–264 mg g 1 (IBA).