Understanding the role of auxins and oxidative enzymes on adventitious root formation in olive (olea europaea L.) cultivars

Olive (Olea europaea L.), one of the main crops in the Mediterranean basin, is mainly propagated by cuttings, a classical propagation method that relies on the ability of the cuttings to form adventitious roots. While some cultivars are easily propagated by this technique, some of the most interesting olive cultivars are considered difficult-to-root which poses a challenge for their preservation and commercialization. Therefore, increasing the current knowledge on adventitious root formation is extremely important for species like olive. This research focuses on evaluating the role of free auxins and oxidative enzymes on adventitious root formation of two olive cultivars with different rooting ability - ‘Galega vulgar’ (difficult-to-root) and ‘Cobrançosa’ (easy-to-root). In this context, free auxin levels and enzyme activities were determined in in vitro-cultured ‘Galega vulgar’ microshoots and in semi-hardwood cuttings of cvs. ‘Galega vulgar’ and ‘Cobrançosa’. To attain this goal, an analytical method for the quantification of free indole-3-acetic acid (IAA) and indole-3-butyric acid (IBA) was developed, which is based on dispersive liquid-liquid microextraction followed by microwave derivatization (DLLME-MAD) and gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. The developed method was validated in terms of linearity, recovery, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) and proved to be useful in the analysis of two very different types of plant tissues. The results from auxin quantification in olive samples point at a relationship between free auxin levels and rooting ability of both microshoots and semihardwood cuttings. A defective IBA-IAA conversion, resulting in a peak of free IAA during initiation phase, seems to be associated with low rooting ability. Likewise, differences in the activity of oxidative enzymes also appear to be related with rooting ability. Higher polyphenol oxidases (PPO) activity is likely related with an easyto- root behavior, while the opposite is true for peroxidases (POX) (including IAA oxidase (IAAox)) activity. A possible hypothesis for adventitious root formation in olive microcuttings is presented herein for the first time. Free auxins, oxidative enzymes, alternative oxidase (AOX) and reactive oxygen species (ROS) are some of the factors that may be involved in this highly complex physiological process. Interestingly, while temporal changes in auxin levels were similar between microshoots and semihardwood cuttings, the conclusions obtained from enzyme activity results in microshoots didn’t translate to semi-hardwood tissues, showing the emerging need for adaptation of classical agronomical research studies to modern techniques; Resumo: Procurando compreender o papel das auxinas e enzimas oxidativas na formação de raízes adventícias em cultivares de oliveira (Olea europaea L.) A oliveira (Olea europaea L.) é uma das principais culturas da bacia Mediterrânica e é propagada maioritariamente por estacaria, um processo altamente dependente da capacidade das estacas para formar raízes adventícias. Enquanto algumas cultivares são fáceis de propagar desta forma, algumas das cultivares de oliveira mais interessantes são consideradas difíceis de enraizar, o que dificulta a sua preservação e comercialização e torna extremamente importante aprofundar o conhecimento sobre o enraizamento adventício desta espécie. Este trabalho foca-se na avaliação do papel das auxinas livres e das enzimas oxidativas na formação de raízes adventícias em duas cultivares de oliveira com diferente capacidade de enraizamento - ‘Galega vulgar’ (difícil de enraizar) e ‘Cobrançosa’ (fácil de enraizar). Neste contexto, determinaram-se os níveis de auxinas livres e as actividades de enzimas oxidativas em microestacas de ‘Galega vulgar’ cultivadas in vitro bem como em estacas semi-lenhosas das cvs. ‘Galega vulgar’ e ‘Cobrançosa’. Para tal foi necessário desenvolver uma metodologia analítica para a quantificação de ácido indol-3-acético (IAA) e ácido indol-3-butírico (IBA), baseada em microextracção dispersiva líquido-líquido (DLLME) seguida de derivatização em microondas (MAD) e análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC/MS). O método desenvolvido foi validado em termos de linearidade, recuperação, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ), e mostrou-se eficaz na análise de dois tipos de tecidos vegetais bastante diferentes. Os resultados da análise de auxinas em amostras de oliveira apontam para uma possível relação entre os níveis de auxinas livres e a capacidade de enraizamento, tanto em microestacas como em estacas semi-lenhosas. Uma conversão IBA-IAA deficiente, que resulta num pico de IAA durante a fase de iniciação, parece estar associada à baixa capacidade de enraizamento. Por outro lado, a capacidade de enraizamento também parece estar relacionada com diferenças na actividade de enzimas oxidativas. Comportamentos fáceis de enraizar estão associados a actividade mais elevada das polifenoloxidases (PPO), enquanto o oposto é verdade para a actividade das peroxidases (POX) (incluindo a IAA oxidase (IAAox)). Neste trabalho propõe-se pela primeira vez uma possível explicação para o enraizamento adventício em microestacas de oliveira. Auxinas livres, enzimas oxidativas, oxidase alternativa (AOX) e espécies reactivas de oxigénio (ROS) são alguns dos factores envolvidos neste processo fisiológico altamente complexo. Curiosamente, enquanto as alterações temporais nos níveis de auxinas foram semelhantes entre microestacas e estacas semi-lenhosas, o mesmo não se observou relativamente à actividade enzimática, o que mostra a necessidade de adaptação dos estudos agronómicos tradicionais às técnicas correntes.

Der hinterhof: proposta "Kunstlerhaus" para quarteirão no Bairro de AuBere Neustadt em Dresden

INTRODUÇÂO: A presente dissertação decorre do trabalho elaborado no âmbito da disciplina de Projecto Avançado III desenvolvido durante o programa Erasmus na Technische Universitãt Dlesden, Alemanha em pareceria com a L’Université de Strasburg, França. O enunciado do exercício dado, intitulado Künstlerhaus\ tinha como premissa a elaboração de um projecto num proeminente quarteirão de esquina no bairro de AuBete Neustadt em Dresden. Pretendia-se a elaboração de uma estratégia que definisse o limite sudoeste do bairro através de um programa cultural, uma Kunstlemaus, residência de artistas, restaurante, zona de exposição, workshops e um auditório - relacionando o programa com a atmosfera artística e alternativa do bairro. A necessidade e entender as forças de estruturação desse bairro, com particularidades extremamente específicas do ponto de vista da interligação de espaços, leva ao estudo e análise de casos que, pela sua semelhança, possam ajudar a esclarecer e informar futuras decisões projectuais. Esta investigação, pelo interesse que foi acumulando, deixa de ser um simples suporte para o caso prático de Neustadt, mas antes uma base de interpretação desta realidade específica, útil e válida para qualquer caso prático em contexto similar. Contrariamente à estruturação inicial, esta investigação adquire maior relevância, no que diz respeito ao seu contributo, e apresenta-se como peça central deste trabalho. Assim, efectua-se uma divisão em dois capítulos: o primeiro denominado "Der Hinterhof- Investigação aplicável”; e o segundo "Caso prático: Aplicação em projecto". Este caso prático não tem a pretensão de ser paradigmático, mas antes uma possibilidade de utilização, ou forma de aplicação dos conceitos apreendidos na primeira instância - esclarecendo, por conseguinte, o sentido desta dissertação. Relativamente á escolha dos elementos a investigar, e de forma mais concreta, esta passou por identificar situações e operações que tivessem como base bairros com princípios urbanos similares dos de Neustadt, bem como características históricas e sociais também semelhantes. Nesse sentido, é analisado o caso da lnternationale Beuausstellung Berlin (IBA) de 1987, pelo tipo de abordagem, em rotura com a tida até então, no que diz respeito à recuperação de centros históricos; é ainda investigada a situação de Kreuzberg, Berlim, pelas suas semelhanças, ao nível do modelo, com AuBere Neustadt; e por fim, é analisado um caso prático - integrado nestes dois contextos (IBA e Kreuzberg)- realizado pelo Arquitecto Siza Vieira, com a intenção de entender a metodologia utilizada na aplicação dos principies pré-estabelecidos. "A cidade, tal como a realidade histórica, nunca é independente das etapas por que passou na sua evolução: é uma actualização dessas etapas e a sua projecção em direcção ao futuro" Berlim e Dresden, cidades do século XIX e XX, tiveram a sua (re)definição urbana na Revolução Industrial e Idade Contemporânea - ambas estas épocas cruciais para o desenvolvimento e reconstrução destas cidades, assim como para a formação de singularidades, nomeadamente a utilização especifica do espaço vazio do quarteirão na estrutura urbana destas cidades. Dresden procura, nos tempos actuais, reencontrar a sua identidade perdida após ter sido palco do maior massacre na II Guerra Mundial (1939-1945) e cobaia do regime da Deutsche Demokratische Republik (DDR). No entanto, uma pequena parcela da cidade manteve-se intacta desde a sua elementar constituição no século XVIII: Aubere Neustadt. Um bairro operário que, com o desenvolvimento histórico, social e político, viu os espaços vazios dos seus quarteirões, associados à rigidez do traçado urbano, serem transformados em concepções personalizadas pelos sobreviventes da guerra e por comunidades alternativas ligadas sobretudo ao mundo das artes. Esse fenómeno iniciou-se na Revolução Industrial com a ocupação fabril dos espaços ainda não construídos da cidade, nomeadamente dentro dos quarteirões, assistindo-se à sobreposição dos interesses económicos sobre o desenho urbano existente. Devido à ausência de um projecto base, essas estruturas foram sendo ocupadas e modificadas por comunidades distintas, compondo o espaço actual numa gramática complexa. Falar de identidade, é falar de apropriar um todo, e compreendê-lo como um acto de unificação. A conjuntura social alemã é a génese de vários factores históricos, alguns dos quais considerados dramáticos. Nos territórios de Dresden e Berlim, inscrevem-se algumas das cicatrizes mais profundas do século XX. Nesse sentido, não são cidades como acto violento contra a natureza, mas antes demonstrações da natureza violenta do homem. Sendo a cidade o reflexo mais imediato das relações humanas e organização em sociedade, as cicatrizes patentes dessa violência criaram um impacto nas estruturas urbanas, socais, históricas e políticas. Morfologicamente, o quarteirão é um elemento urbano que mistura, agrupa e, ao mesmo tempo, divide os espaços públicos dos privados - muitas vezes detentor de ambiguidades na separação destas duas atmosferas. Importa entender o motivo social que leva a que existam espaços semi-públicos e semi-privados. O Hinterhof (espaço urbano vazio do quarteirão) prima, normalmente, por um carácter mais privativo por se encontrar distante da rua. No entanto os seus acessos, nos casos particulares de Dresden e Berlim, são maioritariamente de livre passagem, dando lugar a pátios, jardins, espaços para congregar as pessoas (esplanadas de bares, parques de estacionamento, workshops, parques de crianças, lugar para estender a roupa, festas de bairro, convívio particular, ateliers, horta comunitária, organização de picnics ao fim de semana ...) Os seus papeis não se conseguem definir, tal a sua pluralidade. O pensamento de "partiha" alemão, ainda hoje presente, possibilitou a criação desses espaços plurais semi-privados e semi-públicos. Devido ao facto de terem sido, outrora, o espaço comum de habitação de inúmeros trabalhadores fabris, com um sentido comunitário fixado no pós-guerra, também reflexo das dificuldades e sentido de entre-ajuda social com a imposição do regime da DDR.

Tracking biochemical changes during adventitious root formation in olive (Olea europaea L.)

The activity of oxidative enzymes and the levels of free auxins were determined during adventitious root formation in olive explants. Rooting trials were performed both with in vitro-cultured micro shoots of the cultivar ‘Galega Vulgar’, treated with indole-3-butyric acid (IBA) and with salicylhydroxamic acid(SHAM) + IBA, as well as with semi-hardwood cuttings of the cultivars ‘Galega Vulgar’ (difficult-to-root)and ‘Cobrançosa’ (easy-to-root), treated with IBA. The auxin (IBA) was used in all experiments as a rooting promoter, while SHAM was used in micropropagation trials as rooting inhibitor, providing a negative control. Free indole-3-acetic acid (IAA) and IBA concentrations were determined in microshoots, as well as in semi-hardwood cuttings, throughout the rooting period at pre-established time-points. At the sametime-points, the enzymatic activity of polyphenol oxidases (PPO), peroxidases (POX), and IAA oxidase(IAAox) was evaluated in the microshoots. Microshoots treated with SHAM + IBA revealed higher POX and IAAox activity, as well as lower PPO activity, than those treated only with IBA. IAA levels were higher in IBA-treated microshoots during induction phase, but lower during early initiation phase. Incontrast, free IBA levels were higher in microshoots treated with SHAM + IBA during induction, but lower during initiation. A similar pattern of free auxin levels was observed in semi-hardwood cuttings of the two contrasting cultivars under evaluation. The similarities found on the auxin patterns of microshoots treated with SHAM and those of semi-hardwood cuttings of the difficult-to-root olive cultivar allow considering SHAM a reliable control for when simulation of a difficult-to-root behavior is necessary. The inhibitory effect of SHAM in root formation could be related with 1) the inhibition of alternative oxidase(AOX), leading to a down regulation of phenylpropanoid biosynthetic pathways, which would decrease the concentration of phenolic substrates for PPO; 2) an increase in IAAox activity resulting in lower free IAA levels or; 3) a defective conversion of IBA into IAA.

Quantification of free auxins in semi-hardwood plant cuttings and microshoots by dispersive liquid–liquid microextraction/microwave derivatization and GC/MS analysis

Several studies have suggested that differences in the natural rooting ability of plant cuttings could be attributed to differences in endogenous auxin levels. Hence, during rooting experiments, it is important to be able to routinely monitor the evolution of endogenous levels of plant hormones. This work reports the development of a new method for the quantification of free auxins in auxin-treated Olea europaea (L.) explants, using dispersive liquid–liquid microextraction (DLLME) and microwave assisted derivatization (MAD) followed by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis. Linear ranges of 0.5–500 ng mL 1 and 1–500 mg mL 1 were used for the quantification of indole-3-acetic acid (IAA) and indole-3-butyric acid (IBA), respectively. Determined by serial dilutions, the limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were 0.05 ng mL 1 and 0.25 ng mL 1, respectively for both compounds. When using the calibration curve for determination, the LOQ corresponded to 0.5 ng mL 1 (IAA) and 0.5 mg mL 1 (IBA). The proposed method proved to be substantially faster than other alternatives, and allowed free auxin quantification in real samples of semi-hardwood cuttings and microshoots of two olive cultivars. The concentrations found in the analyzed samples are in the range of 0.131–0.342 mg g 1 (IAA) and 20–264 mg g 1 (IBA).