Morphobiometric and molecular characterization of Bursaphelenchus Fuchs, 1937 (Nematoda: Aphelenchoididae) species associated with Pinus pinaster Ainton in Portugal

Abstract - The genus Bursaphelenchus comprises almost 100 species mainly from the northern hemisphere, with conifers as the most important hosts. Among the various nematode species, the pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is the casual agent of pine wilt disease (PWD), and the most important forest pest for pines worldwide, classified as an A1 quarantine organism within the European Union. In 1999 this nematode was detected for the first time in Portugal and Europa associated with maritime pine, Pinus pinaster. Following detection, a national program denominated "Programa Nacional de Luta contra o Nem��todo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) was created to, among other objectives, determine the distribution of the PWN and its associated vector(s) and host(s), and therefore intensive surveys covering the entire country were conducted with thousands of wood samples and suspected insects being analyzed. This thesis presents the listing, distribution, frequency and the insects associated with Bursaphelenchus species found associated with maritime pine in Portugal, identifying and characterizing the various species by morphological, biometrical and molecular biology (ITS-RFLP and rDNA sequencing analysis) techniques. To achieve the objectives, a total of 4813 maritime pine wood samples and 3294 insects from 22 species and six families were individually analyzed. A total of nine Bursaphelenchus species were found, namely: B. antoniae, B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae and B. xylophilus, all of them (with the exception of B. xylophilus) being new records for Portugal. Some of the species appear to have a widespread distribution, such as B. leoni, B. teratospicularis and B. tusciae while others were very rarely found and apparently have a localized distribution range within the country, namely B. antoniae and B. mucronatus. The majority of the species is characteristic of the Mediterranean region and can also be found in countries such as Spain, Italy and Greece, reflecting the affinity of our fauna with those locations. The association of B. hellenicus and B. tusciae with maritime pine is here reported for the first time. Six of the Bursaphelenchus species were also found associated with insects, mainly from the family Scolytidae (Coleoptera). Some of these interactions were described for the first time, namely: B. hellenicus with both Ips sexdentatus and Hylurgus ligniperda, B. sexdentati with both H. ligniperda and Orthotomicus erosus and B. tusciae with H. ligniperda. The exclusive association of B. xylophilus with the cerambycid Monochamus galloprovincialis was also confirmed. The nematode's dauer juveniles were usually found in low numbers in the insect vectors (ca 10-100 per insect), although for B. xylophilus a few thousand specimens per insect were sometimes found. The location of the dauer juveniles differed according to the species, although they were more common under the elytra and wings of the adult insects. A species new to science was detected and formally described as B. antoniae, associated with Hylobius sp. (Coleoptera; Curculionidae) beetles. Morphologically, this new species is very similar to B. hylobianum, although it's distinct ITS-RFLP molecular pattern (with only the enzyme Haelll producing comparable restriction bands) and the failure of hybridization supported the two species as distinct entities. Additional phylogenetic analysis of the 18S rDNA sequence further supported the taxonomical proximity of B. antoniae with B. hylobianum. Concerning the PWN, detailed studies on the development and morphology of B. xylophilus were conducted, and comparative measurements of field-collected and laboratory-maintained populations demonstrated that nematodes from the second group displayed larger size in all morphometric parameters, which could derive from more adequate conditions of nourishment and/or temperature. Taxonomical studies on the development stages of B. xylophilus confirmed the existence of four propagative juvenile stages (J1,J2,J3 and J4), an adult stage with both sexes and two dispersal stages (jIII e jIV), with the measurements of the gonad length allowing the separation of the propagative stages. It is hoped that the acquired knowledge will be useful on future surveys of nematodes of the Bursaphelenchus genus collected from either wood material or insect vectors, and facilitate the correct distinction and identification of the various species which are now known to occur. ### Resumo - 0 g��nero Bursaphelenchus compreende quase 100 esp��cies, distribu��das sobretudo nos pa��ses do hemisf��rio norte do globo terrestre. Embora algumas esp��cies j�� tenham sido detectadas em plantas herb��ceas, os hospedeiros vegetais mais comuns deste g��nero s��o as con��feras, particularmente pinheiros. 0 nem��tode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus, �� considerado a esp��cie mais importante deste g��nero uma vez que �� o agente causal da doen��a da murchid��o dos pinheiros ("pine wilt disease"). Origin��rio dos Estados Unidos, onde n��o causa grande impacte, o NMP foi introduzido em alguns pa��ses da ��sia (China, Jap��o, Coreia e Taiwan) e mais recentemente na Europa (Portugal). Nestas regi��es �� respons��vel pela destrui����o de milhares de hectares de con��feras, assumindo uma elevada import��ncia econ��mica. Em Portugal, depois da sua detec����o em 1999, associado a Pinus pinaster, foi implementado um programa nacional "Programa Nacional de Luta contra o Nem��todo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) que permitiu determinar a ��rea afectada pela praga (a sul do rio Tejo, pen��nsula de Set��bal) bem como definir e implementar estrat��gias de controlo e preven����o da dissemina����o do NMP a outras zonas de Portugal. Recentemente, em Junho de 2008, foi confirmada a presen��a de B. xylophilus em outras regi��es de Portugal levando as autoridades oficiais a definir todo o territ��rio continental como zona afectada e de restri����o. As prospec����es intensivas realizadas nos ��ltimos anos inclu��ram a recolha e an��lise de milhares de amostras de madeira de pinheiro bem como de insectos associados ao pinheiro bravo conduzindo �� identifica����o de v��rias esp��cies de Bursaphelenchus. Assim, os estudos conduzidos neste trabalho tiveram como objectivos efectuar uma caracteriza����o morfol��gica, biom��trica e molecular das esp��cies associadas a P. pinaster em Portugal bem como a sua distribui����o geogr��fica e abund��ncia. Os estudos biom��tricos foram realizados com popula����es extra��das directamente do meio natural. Foi ainda realizada uma pesquisa que permitiu identificar os insectos a que est��o associadas essas esp��cies, os seus poss��veis vectores. Foram analisadas no total 4813 amostras de P. pinaster e 3294 insectos (22 esp��cies pertencentes a seis fam��lias diferentes). Foram identificadas um total de nove esp��cies: B. antoniae n. sp., B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae e B. xylophilus. Foram realizados estudos morfol��gicos e biom��tricos de todas as esp��cies com excep����o de B. mucronatus; o reduzido n��mero de exemplares encontrados em apenas uma amostra foram utilizados para efectuar o diagn��stico molecular desta esp��cie (ITS-RFLP). Apesar de ter havido, sempre que poss��vel, a confirma����o molecular, na maioria dos casos a caracteriza����o morfol��gica e biom��trica permitiu a correcta identifica����o das esp��cies. Contudo, foi imprescind��vel a an��lise molecular em algumas amostras, nomeadamente para a identifica����o de B. xylophilus e B. sexdentati; dada a grande semelhan��a entre B. xylophilus e B. mucronatus e tendo sido encontradas algumas popula����es de B. xylophilus que possu��am f��meas com cauda mucronada, foi necess��ria a realiza����o da confirma����o molecular. Com excep����o de B. xylophilus, todas as outras esp��cies foram reportadas pela primeira vez em Portugal. Juntamente com B. xylophilus, B. pinasteri foi a esp��cie encontrada nas amostras de madeira de pinheiro com maior frequ��ncia. Algumas destas esp��cies como B. leoni, B. teratospicularis e B. tusciae foram reportadas em diferentes localidades do norte, centro e sul de Portugal, apresentando uma vasta distribui����o geogr��fica; este resultado est�� em conson��ncia com a forte associa����o destas esp��cies a climas mediterr��nicos tal como acontece em Espanha, Fran��a, It��lia e Grécia. Em oposi����o, esp��cies como B. antoniae e B. mucronatus foram encontradas apenas numa ocasi��o na regi��o centro (Leiria) e norte (Figueira da Foz) do pa��s, respectivamente. Bursaphelenchus mucronatus �� igualmente pouco frequente em Espanha onde ocorre sobretudo na regi��o norte, na Galiza. Esta esp��cie preferir�� climas mais frios, ocorrendo com uma maior frequ��ncia nas regi��es de latitude norte; esta an��lise �� corroborada pela presen��a constante em pa��ses como Alemanha, Finl��ndia, Fran��a, Noruega, R��ssia e Su��cia. A n��vel mundial s��o descritas neste trabalho pela primeira vez as associa����es das esp��cies B. hellenicus e B. tusciae ao hospedeiro vegetal P. pinaster.