Understanding the role of auxins and oxidative enzymes on adventitious root formation in olive (olea europaea L.) cultivars

Olive (Olea europaea L.), one of the main crops in the Mediterranean basin, is mainly propagated by cuttings, a classical propagation method that relies on the ability of the cuttings to form adventitious roots. While some cultivars are easily propagated by this technique, some of the most interesting olive cultivars are considered difficult-to-root which poses a challenge for their preservation and commercialization. Therefore, increasing the current knowledge on adventitious root formation is extremely important for species like olive. This research focuses on evaluating the role of free auxins and oxidative enzymes on adventitious root formation of two olive cultivars with different rooting ability - ‘Galega vulgar’ (difficult-to-root) and ‘Cobrançosa’ (easy-to-root). In this context, free auxin levels and enzyme activities were determined in in vitro-cultured ‘Galega vulgar’ microshoots and in semi-hardwood cuttings of cvs. ‘Galega vulgar’ and ‘Cobrançosa’. To attain this goal, an analytical method for the quantification of free indole-3-acetic acid (IAA) and indole-3-butyric acid (IBA) was developed, which is based on dispersive liquid-liquid microextraction followed by microwave derivatization (DLLME-MAD) and gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. The developed method was validated in terms of linearity, recovery, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) and proved to be useful in the analysis of two very different types of plant tissues. The results from auxin quantification in olive samples point at a relationship between free auxin levels and rooting ability of both microshoots and semihardwood cuttings. A defective IBA-IAA conversion, resulting in a peak of free IAA during initiation phase, seems to be associated with low rooting ability. Likewise, differences in the activity of oxidative enzymes also appear to be related with rooting ability. Higher polyphenol oxidases (PPO) activity is likely related with an easyto- root behavior, while the opposite is true for peroxidases (POX) (including IAA oxidase (IAAox)) activity. A possible hypothesis for adventitious root formation in olive microcuttings is presented herein for the first time. Free auxins, oxidative enzymes, alternative oxidase (AOX) and reactive oxygen species (ROS) are some of the factors that may be involved in this highly complex physiological process. Interestingly, while temporal changes in auxin levels were similar between microshoots and semihardwood cuttings, the conclusions obtained from enzyme activity results in microshoots didn’t translate to semi-hardwood tissues, showing the emerging need for adaptation of classical agronomical research studies to modern techniques; Resumo: Procurando compreender o papel das auxinas e enzimas oxidativas na formação de raízes adventícias em cultivares de oliveira (Olea europaea L.) A oliveira (Olea europaea L.) é uma das principais culturas da bacia Mediterrânica e é propagada maioritariamente por estacaria, um processo altamente dependente da capacidade das estacas para formar raízes adventícias. Enquanto algumas cultivares são fáceis de propagar desta forma, algumas das cultivares de oliveira mais interessantes são consideradas difíceis de enraizar, o que dificulta a sua preservação e comercialização e torna extremamente importante aprofundar o conhecimento sobre o enraizamento adventício desta espécie. Este trabalho foca-se na avaliação do papel das auxinas livres e das enzimas oxidativas na formação de raízes adventícias em duas cultivares de oliveira com diferente capacidade de enraizamento - ‘Galega vulgar’ (difícil de enraizar) e ‘Cobrançosa’ (fácil de enraizar). Neste contexto, determinaram-se os níveis de auxinas livres e as actividades de enzimas oxidativas em microestacas de ‘Galega vulgar’ cultivadas in vitro bem como em estacas semi-lenhosas das cvs. ‘Galega vulgar’ e ‘Cobrançosa’. Para tal foi necessário desenvolver uma metodologia analítica para a quantificação de ácido indol-3-acético (IAA) e ácido indol-3-butírico (IBA), baseada em microextracção dispersiva líquido-líquido (DLLME) seguida de derivatização em microondas (MAD) e análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC/MS). O método desenvolvido foi validado em termos de linearidade, recuperação, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ), e mostrou-se eficaz na análise de dois tipos de tecidos vegetais bastante diferentes. Os resultados da análise de auxinas em amostras de oliveira apontam para uma possível relação entre os níveis de auxinas livres e a capacidade de enraizamento, tanto em microestacas como em estacas semi-lenhosas. Uma conversão IBA-IAA deficiente, que resulta num pico de IAA durante a fase de iniciação, parece estar associada à baixa capacidade de enraizamento. Por outro lado, a capacidade de enraizamento também parece estar relacionada com diferenças na actividade de enzimas oxidativas. Comportamentos fáceis de enraizar estão associados a actividade mais elevada das polifenoloxidases (PPO), enquanto o oposto é verdade para a actividade das peroxidases (POX) (incluindo a IAA oxidase (IAAox)). Neste trabalho propõe-se pela primeira vez uma possível explicação para o enraizamento adventício em microestacas de oliveira. Auxinas livres, enzimas oxidativas, oxidase alternativa (AOX) e espécies reactivas de oxigénio (ROS) são alguns dos factores envolvidos neste processo fisiológico altamente complexo. Curiosamente, enquanto as alterações temporais nos níveis de auxinas foram semelhantes entre microestacas e estacas semi-lenhosas, o mesmo não se observou relativamente à actividade enzimática, o que mostra a necessidade de adaptação dos estudos agronómicos tradicionais às técnicas correntes.

Contributo para o conhecimento do povoamento rural romano no concelho de Montemor-o-Novo: caso da barragem dos minutos

O concelho de Montemor-o-Novo é rico em vestígios arqueológicos de várias cronologias, pelo que a época romana não é excepção. Durante muito tempo pouco se conhecia deste período cronológico, particularmente a forma do seu povoamento. Durante os anos 60 do século XX, foram identificadas e escavadas algumas estruturas deste período, nomeadamente a Fonte do Prior, o Curral dos Cães e o Cabeço do Ceivo. No entanto, foi durante as obras da Barragem dos Minutos que começamos a ter uma nova perceção de como seria o povoamento romano neste território. Sítios como estes têm vindo, ao longo do tempo, a ser colocados de parte quando se falava sobre a romanização dos campos por se considerar que essa ocupação era exclusiva das luxuosas villae e por se pensar que estes sítios fariam parte das villae. Neste trabalho iremos ver o resultado das intervenções realizados na Barragem dos Minutos, bem como as realizadas no regolfo da Barragem de Alqueva com o objectivo de tentar perceber estas novas realidades do povoamento romano; Abstract: The Montemor-o-Novo municipality is rich in archaeological remains of various chronologies, so the Roman era is no exception. But for a long time little was known of this chronological period and especially the shape of your settlement. During the 60s of the twentieth century, they have been identified and excavated some structures of this period, namely the Fonte do Prior, the Curral dos Cães and the Cabeço Ceivo. But it was during the construction of the dam of Minutos we started to have a new perception of how would the Roman settlement in this territory. Sites like these have been, over time, to be put aside when talking about the romanization of the fields in Roman times as it was considered that this occupation was exclusive of villae luxurious and think that these sites would be part of the villae. In this work we will see the result of the work done at the dam of the Minutos, as well as the work carried out in the surroundings of the Alqueva Dam and try to understand these new realities of the Roman settlement.

O comprimento descritivo mínimo na amostragem por transectos lineares

Apresenta·se um breve resumo histórico da evolução da amostragem por transectos lineares e desenvolve·se a sua teoria. Descrevemos a teoria de amostragem por transectos lineares, proposta por Buckland (1992), sendo apresentados os pontos mais relevantes, no que diz respeito à modelação da função de detecção. Apresentamos uma descrição do princípio CDM (Rissanen, 1978) e a sua aplicação à estimação de uma função densidade por um histograma (Kontkanen e Myllymãki, 2006), procedendo à aplicação de um exemplo prático, recorrendo a uma mistura de densidades. Procedemos à sua aplicação ao cálculo do estimador da probabilidade de detecção, no caso dos transectos lineares e desta forma estimar a densidade populacional de animais. Analisamos dois casos práticos, clássicos na amostragem por distâncias, comparando os resultados obtidos. De forma a avaliar a metodologia, simulámos vários conjuntos de observações, tendo como base o exemplo das estacas, recorrendo às funções de detecção semi-normal, taxa de risco, exponencial e uniforme com um cosseno. Os resultados foram obtidos com o programa DISTANCE (Thomas et al., in press) e um algoritmo escrito em linguagem C, cedido pelo Professor Doutor Petri Kontkanen (Departamento de Ciências da Computação, Universidade de Helsínquia). Foram desenvolvidos programas de forma a calcular intervalos de confiança recorrendo à técnica bootstrap (Efron, 1978). São discutidos os resultados finais e apresentadas sugestões de desenvolvimentos futuros. ABSTRACT; We present a brief historical note on the evolution of line transect sampling and its theoretical developments. We describe line transect sampling theory as proposed by Buckland (1992), and present the most relevant issues about modeling the detection function. We present a description of the CDM principle (Rissanen, 1978) and its application to histogram density estimation (Kontkanen and Myllymãki, 2006), with a practical example, using a mixture of densities. We proceed with the application and estimate probability of detection and animal population density in the context of line transect sampling. Two classical examples from the literature are analyzed and compared. ln order to evaluate the proposed methodology, we carry out a simulation study based on a wooden stakes example, and using as detection functions half normal, hazard rate, exponential and uniform with a cosine term. The results were obtained using program DISTANCE (Thomas et al., in press), and an algorithm written in C language, kindly offered by Professor Petri Kontkanen (Department of Computer Science, University of Helsinki). We develop some programs in order to estimate confidence intervals using the bootstrap technique (Efron, 1978). Finally, the results are presented and discussed with suggestions for future developments.

Simplificação do processo de multiplicação in vitro da oliveira "Olea europaea L."

A oliveira tem sido multiplicada ao longo dos tempos por métodos convencionais de propagação vegetativa como a enxertia e a estacaria lenhosa e semilenhosa. No entanto, estes métodos revelam-se lentos ou ineficientes para determinadas cultivares. No caso da cv. ‘Galega Vulgar’, ainda com grande expressão no olival português, e de difícil enraizamento por estacaria semilenhosa, tem sido usada a micropropagação de modo a contornar essas limitações e assim obter um elevado número de plantas em curto período de tempo. O custo final de produção por este processo ainda é elevado, podendo comprometer a sua aplicação a nível comercial. Grande parte dos custos estão relacionados com a fase de enraizamento in vitro que carece de ambiente estéril e condições de assépsia para a sua execução. Com vista a uma redução de custos associados a esta fase de produção, pretendeu-se com este trabalho testar a viabilidade do enraizamento ex vitro, na ausência de condições de assépsia. Este método poderá permitir uma significativa redução da mão-de-obra, ao mesmo tempo que facilitará a aclimatização das plantas e a obtenção de um sistema radicular de melhor qualidade. Compararam-se as taxas de enraizamento in vitro (controlo), com as obtidas ex vitro. Foram utilizados explantes provenientes de dois clones da cv. ‘Galega Vulgar’, (cl. 1441 e cl. 2022) cultivados e mantidos in vitro há vários anos no Laboratório de Melhoramento e Biotecnologia da Universidade de Évora. Para além do clone foi avaliada a influência do tipo de estaca (basal e apical), da hormona de enraizamento (AIB e ANA), da sua concentração (540 e 3000 ppm) e ainda de dois substratos, Preformas Jiffy® e pastilhas de fibra coco. Os melhores resultados foram obtidos com o clone 1441 em pastilhas de fibra de coco prensada, com o uso de estacas basais. Quanto à auxina, não se observaram diferenças significativas entre a utilização de ANA na concentração de 540 ppm e AIB na concentração de 3000 ppm. A aclimatização das plantas foi conseguida com taxas elevadas de sucesso, independentemente do tratamento utilizado. Conclui-se que a aplicação do método de enraizamento ex vitro simplifica procedimentos e mantém taxas de enraizamento elevadas, conduzindo assim a uma efetiva redução de tempo e custos associados; Simplifying procedures for in vitro propagation of olive “Olea europaea L.” Abstract: The olive tree has been multiplied throughout the ages by conventional methods of vegetative propagation such as grafting and wood or softwood cuttings. These propagation methods are somehow inefficient for certain cultivars. For the CV. ‘Galega Vulgar‘, still with great expression in Portuguese olive orchards, propagation has been attempted by in vitro culture in order to circumvent these limitations and so obtain a large number of plants in short time period. The final production fees associated to this process are still high which may compromise its application to a commercial level. Most of this process fees are related to the in vitro rooting phase which lacks sterile and aseptic conditions for its implementation. Aiming to reduce the costs associated with this production phase, this work tested the feasibility of the ex vitro rooting in the absence of aseptic conditions, which can allow a significant reduction of the manpower involved and an easier plant acclimatization due to its transplant with a balled-root system. In vitro rooting rates (control) were compared with those obtained with the ex vitro experiments. Explants from two clones of the cv. ‘Galega Vulgar‘ (cl. 1441 and cl. 2022), grown and maintained in vitro for several years in the Laboratory of Biotechnology and Plant Breeding of the University of Évora, were used in the trials. In addition to the clone, the effect of the cutting type (basal and apical), the rooting hormone (AIB and ANA), their concentration (540 and 3000 ppm) and two substrates, Preformas Jiffy ® and pressed coco fiber pellets, were also evaluated. The best results were obtained with the clone 1441, when rooted in pressed coco fiber pellets, using basal cuttings. Under this conditions no significant differences were observed between the use of ANA at 540 ppm or AIB in the 3000 ppm. Acclimatization of plants was achieved with high rates of success, regardless of the treatment used. It can be concluded that the application of the ex vitro rooting method allows to maintain high rooting rates, contributing for an effective reduction of time and fees of the rooting process.