Avaliação do perfil morfológico de esporos de nosema spp. Presentes em colónias de Apis mellifera L. localizadas na região centro de Portugal

O género Nosema inclui várias espécies que são patogénicas para muitos insetos, designadamente alguns pertencentes às ordens Lepidóptera ou Himenóptera. A Apis mellifera L. não é neste último domínio exceção, podendo nas suas colónias serem infetadas as obreiras, os zângãos ou as rainhas. A nosemose é uma das principais doenças que afeta o efetivo apícola português, pertencendo à lista das doenças doenças de declaração obrigatória (D.D.O.) a nível nacional. Embora os esporos das duas espécies causadoras desta doença em abelhas melíferas (N apis e N ceranae) sejam algumas vezes apresentados como suficientemente distintos (apresentando características específicas, entre outras, ao nível do tamanho e forma), são escassos os estudos dirigidos à sua avaliação morfobiométrica. Neste contexto, entendeu-se relevante a avaliação do perfil morfológico dos esporos do género Nosema, encontrados em colónias de abelhas melíferas em apiários localizados na área de influência da Associação de Apicultores da Região de Leiria (AARL), nomeadamentes nos distritos de Guarda, Santarém, Viseu, Leiria e Évora. A amostragem incidiu sobre um total de 96 amostras que foram analisadas de acordo com a metodologia praticada no Laboratório de Patologia Apícola da Escola Superior Agrária de Bragança (microscopia ótica de campo claro, com quantificação de esporos em câmara de Neubauer). Das amostras estudadas, 68 revelaram-se positivas para o género Nosema. Nestes casos, estudou-se o perfil morfológico (comprimento e largura) dos esporos (utilizando o software VisiCam Image Analyser 7). Para este efeito foram fotografados cinco esporos de cada amostra, os quais serviram de suporte às medições efetuadas. A informação recolhida nas diferentes variáveis estudadas foi sujeita a análise de variância (ANOVA), no sentido de investigar a possível existência de médias significativamente diferentes (P<0.05) que pudessem ser atribuídas ao ano ou distrito de amostragem. Como principal conclusão, os esporos de Nosema spp. encontrados nas colónias de abelhas melíferas portuguesas (A m iberiensis) estudadas revelaram-se morfometricamente uniformes (quer em cumprimento quer em largura), sem apresentarem diferenças consideráveis que possam ser associadas a diferentes anos de amostragem ou à localização geográfica das colónias infetadas ao nível do distrito. Esta situação aparenta corroborar resultados moleculares anteriormente obtidos pelo grupo de investigação, onde se demonstrou a presença exclusiva de Nosema ceranae na parte continental de Portugal.

Infecção de mycobacterium bovis em células fagocíticas: estratégia aplicada ao diagnóstico da tuberculose bovina

Neste trabalho foram estudadas as interacções entre Mycobacterium bovis e células hospedeiras, na perspectiva de aplicar os conhecimentos resultantes desse estudo ao melhoramento do diagnóstico da tuberculose bovina. Foi estudada a dinâmica da infecção de células fagocíticas com estirpes de M. bovis, com ênfase para a invasão e multiplicação intracelular das micobactérias. Avaliações efectuadas por citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e contagem de colónias demonstraram que as micobactérias invadiram e replicaram em todos os modelos celulares, sendo que as células epiteliais de pulmão de bovino foram as mais permissivas ao seu crescimento. Foi nas células macrofágicas J774 e THP-1 que se verificaram as maiores concentrações micobacterianas, pelo que foram utilizadas para a detecção e identificação de M. bovis por um método molecular. A optimização da extracção de DNA, por um processo mecânico, e o desenvolvimento do método de PCR-RFLP baseado no gene gyrB, com controlo interno, permitiram a identificação de M. bovis. A sensibilidade deste método foi de 100% quando aplicado a estirpes isoladas e apenas de 40% quando utilizado directamente em amostras de macerados de tecidos de bovinos com tuberculose. Uma pré-incubação (3 dias) das amostras nas culturas celulares contribuiu para melhorar significativamente a sensibilidade (77%) do PCR-RFLP gyrB. A cultura celular, como matriz a ser utilizada para aumentar a quantidade de M. bovis presente em amostras biológicas, revela-se um método promissor para o diagnóstico laboratorial rápido, específico e sensível da tuberculose bovina. ### - Summary - Interactions between Mycobacterium bovis and host cells were studied with the purpose to apply the outcome knowledge in the improvement of bovine tuberculosis diagnosis. The dynamic of infection of four cell models with three strains of M. bovis was evaluated, with emphasis given to the invasion and intracellular multiplication of mycobacteria. Assessments by flow cytometry, fluorescence microscopy and colony counting showed that every cell models permitted the replication of mycobacteria, although bovine lung epithelial cells had been the most permissive one. The highest mycobacteria) load was found, however, in J774 and THP-1 macrophages, and hence these cells were used for the optimization of a molecular method for detection and identification of M. bovis. The optimisation of a DNA extraction step, by a mechanical process, and the development of PCR-RFLP based on gyrB gene, with an internal control, allowed the identification of M. bovis. The sensitivity of this method was 100% when applied to isolated strains and only 40% when directly used on samples of macerated of tissues from cattle with tuberculosis. Assays in which a pre-incubation step (three days) of biological samples in cell cultures was introduced significantly improved the sensitivity (77%) of the gyrB PCR-RFLP. Cell cultures as a support for growth and rapid isolation of M. bovis is a promising method for the specific, sensitive and rapid laboratorial diagnosis of bovine tuberculosis.