Morphobiometric and molecular characterization of Bursaphelenchus Fuchs, 1937 (Nematoda: Aphelenchoididae) species associated with Pinus pinaster Ainton in Portugal

Abstract - The genus Bursaphelenchus comprises almost 100 species mainly from the northern hemisphere, with conifers as the most important hosts. Among the various nematode species, the pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is the casual agent of pine wilt disease (PWD), and the most important forest pest for pines worldwide, classified as an A1 quarantine organism within the European Union. In 1999 this nematode was detected for the first time in Portugal and Europa associated with maritime pine, Pinus pinaster. Following detection, a national program denominated "Programa Nacional de Luta contra o Nemátodo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) was created to, among other objectives, determine the distribution of the PWN and its associated vector(s) and host(s), and therefore intensive surveys covering the entire country were conducted with thousands of wood samples and suspected insects being analyzed. This thesis presents the listing, distribution, frequency and the insects associated with Bursaphelenchus species found associated with maritime pine in Portugal, identifying and characterizing the various species by morphological, biometrical and molecular biology (ITS-RFLP and rDNA sequencing analysis) techniques. To achieve the objectives, a total of 4813 maritime pine wood samples and 3294 insects from 22 species and six families were individually analyzed. A total of nine Bursaphelenchus species were found, namely: B. antoniae, B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae and B. xylophilus, all of them (with the exception of B. xylophilus) being new records for Portugal. Some of the species appear to have a widespread distribution, such as B. leoni, B. teratospicularis and B. tusciae while others were very rarely found and apparently have a localized distribution range within the country, namely B. antoniae and B. mucronatus. The majority of the species is characteristic of the Mediterranean region and can also be found in countries such as Spain, Italy and Greece, reflecting the affinity of our fauna with those locations. The association of B. hellenicus and B. tusciae with maritime pine is here reported for the first time. Six of the Bursaphelenchus species were also found associated with insects, mainly from the family Scolytidae (Coleoptera). Some of these interactions were described for the first time, namely: B. hellenicus with both Ips sexdentatus and Hylurgus ligniperda, B. sexdentati with both H. ligniperda and Orthotomicus erosus and B. tusciae with H. ligniperda. The exclusive association of B. xylophilus with the cerambycid Monochamus galloprovincialis was also confirmed. The nematode's dauer juveniles were usually found in low numbers in the insect vectors (ca 10-100 per insect), although for B. xylophilus a few thousand specimens per insect were sometimes found. The location of the dauer juveniles differed according to the species, although they were more common under the elytra and wings of the adult insects. A species new to science was detected and formally described as B. antoniae, associated with Hylobius sp. (Coleoptera; Curculionidae) beetles. Morphologically, this new species is very similar to B. hylobianum, although it's distinct ITS-RFLP molecular pattern (with only the enzyme Haelll producing comparable restriction bands) and the failure of hybridization supported the two species as distinct entities. Additional phylogenetic analysis of the 18S rDNA sequence further supported the taxonomical proximity of B. antoniae with B. hylobianum. Concerning the PWN, detailed studies on the development and morphology of B. xylophilus were conducted, and comparative measurements of field-collected and laboratory-maintained populations demonstrated that nematodes from the second group displayed larger size in all morphometric parameters, which could derive from more adequate conditions of nourishment and/or temperature. Taxonomical studies on the development stages of B. xylophilus confirmed the existence of four propagative juvenile stages (J1,J2,J3 and J4), an adult stage with both sexes and two dispersal stages (jIII e jIV), with the measurements of the gonad length allowing the separation of the propagative stages. It is hoped that the acquired knowledge will be useful on future surveys of nematodes of the Bursaphelenchus genus collected from either wood material or insect vectors, and facilitate the correct distinction and identification of the various species which are now known to occur. ### Resumo - 0 género Bursaphelenchus compreende quase 100 espécies, distribuídas sobretudo nos países do hemisfério norte do globo terrestre. Embora algumas espécies já tenham sido detectadas em plantas herbáceas, os hospedeiros vegetais mais comuns deste género são as coníferas, particularmente pinheiros. 0 nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus, é considerado a espécie mais importante deste género uma vez que é o agente causal da doença da murchidão dos pinheiros ("pine wilt disease"). Originário dos Estados Unidos, onde não causa grande impacte, o NMP foi introduzido em alguns países da Ásia (China, Japão, Coreia e Taiwan) e mais recentemente na Europa (Portugal). Nestas regiões é responsável pela destruição de milhares de hectares de coníferas, assumindo uma elevada importância económica. Em Portugal, depois da sua detecção em 1999, associado a Pinus pinaster, foi implementado um programa nacional "Programa Nacional de Luta contra o Nemátodo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) que permitiu determinar a área afectada pela praga (a sul do rio Tejo, península de Setúbal) bem como definir e implementar estratégias de controlo e prevenção da disseminação do NMP a outras zonas de Portugal. Recentemente, em Junho de 2008, foi confirmada a presença de B. xylophilus em outras regiões de Portugal levando as autoridades oficiais a definir todo o território continental como zona afectada e de restrição. As prospecções intensivas realizadas nos últimos anos incluíram a recolha e análise de milhares de amostras de madeira de pinheiro bem como de insectos associados ao pinheiro bravo conduzindo à identificação de várias espécies de Bursaphelenchus. Assim, os estudos conduzidos neste trabalho tiveram como objectivos efectuar uma caracterização morfológica, biométrica e molecular das espécies associadas a P. pinaster em Portugal bem como a sua distribuição geográfica e abundância. Os estudos biométricos foram realizados com populações extraídas directamente do meio natural. Foi ainda realizada uma pesquisa que permitiu identificar os insectos a que estão associadas essas espécies, os seus possíveis vectores. Foram analisadas no total 4813 amostras de P. pinaster e 3294 insectos (22 espécies pertencentes a seis famílias diferentes). Foram identificadas um total de nove espécies: B. antoniae n. sp., B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae e B. xylophilus. Foram realizados estudos morfológicos e biométricos de todas as espécies com excepção de B. mucronatus; o reduzido número de exemplares encontrados em apenas uma amostra foram utilizados para efectuar o diagnóstico molecular desta espécie (ITS-RFLP). Apesar de ter havido, sempre que possível, a confirmação molecular, na maioria dos casos a caracterização morfológica e biométrica permitiu a correcta identificação das espécies. Contudo, foi imprescindível a análise molecular em algumas amostras, nomeadamente para a identificação de B. xylophilus e B. sexdentati; dada a grande semelhança entre B. xylophilus e B. mucronatus e tendo sido encontradas algumas populações de B. xylophilus que possuíam fêmeas com cauda mucronada, foi necessária a realização da confirmação molecular. Com excepção de B. xylophilus, todas as outras espécies foram reportadas pela primeira vez em Portugal. Juntamente com B. xylophilus, B. pinasteri foi a espécie encontrada nas amostras de madeira de pinheiro com maior frequência. Algumas destas espécies como B. leoni, B. teratospicularis e B. tusciae foram reportadas em diferentes localidades do norte, centro e sul de Portugal, apresentando uma vasta distribuição geográfica; este resultado está em consonância com a forte associação destas espécies a climas mediterrânicos tal como acontece em Espanha, França, Itália e Grécia. Em oposição, espécies como B. antoniae e B. mucronatus foram encontradas apenas numa ocasião na região centro (Leiria) e norte (Figueira da Foz) do país, respectivamente. Bursaphelenchus mucronatus é igualmente pouco frequente em Espanha onde ocorre sobretudo na região norte, na Galiza. Esta espécie preferirá climas mais frios, ocorrendo com uma maior frequência nas regiões de latitude norte; esta análise é corroborada pela presença constante em países como Alemanha, Finlândia, França, Noruega, Rússia e Suécia. A nível mundial são descritas neste trabalho pela primeira vez as associações das espécies B. hellenicus e B. tusciae ao hospedeiro vegetal P. pinaster.

Assessment of the genetic diversity of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, in Portugal

O nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophiius, tem uma extensa distribuição na América do Norte, e encontra-se atualmente distribuído ao longo da maioria dos territórios de Canadá e dos Estados Unidos. Durante o último século, esta espécie foi transportada pelo Homem para outras regiões do mundo (não-nativas), associadas com o comércio e o fluxo global de produtos de origem florestal. Atualmente, esta espécie invasiva está reportada para algumas regiões do SE asiático (China, Japão, Coreia e Taiwan) e mais recentemente para a Europa (Portugal). Devido ao impacto que este organismo agente da doença da murchidão dos pinheiros causa nas florestas nativas destas regiões esta espécie assume uma elevada importância económica a nível mundial Em Portugal, a distribuição do NMP encontra-se confinada a uma área restrita e limitada (500 000 ha), a sul de Lisboa (península de Setúbal); contudo, constitui uma das maiores ameaças às florestas de pinheiro do país e da UE. Ate recentemente, nenhum consenso existia quanto à origem do NMP em Portugal. Diversas hipóteses têm sido colocadas para explicar esta introdução, nomeadamente a partir de zonas onde o nematode ocorre naturalmente (América do Norte), ou de outras áreas (não-nativas) onde o nematode se comporta como uma espécie invasiva (Leste da Ásia). A fim de avaliar a variabilidade genética do NMP proveniente da área afetada em Portugal, foram utilizadas várias técnicas moleculares, designadamente o random amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR) e o satellite DNA (satDNA). No caso do RAPD-PCR, foram utilizados 24 isolados do NMP provenientes de Portugal, 1 proveniente da América do Norte e 1 da Ásia, tendo sido utilizado como out-group um isolado de B. mucronatus. A partir dos 28 RAPD primers utilizados obtiveram-se 640 fragmentos. No caso do satDNA, foram utilizados 21 isolados do NMP provenientes de Portugal, obtendo-se no total 206 sequências da família MspI. Ambos os métodos revelaram uma elevada similaridade genética entre os vários isolados do NMP da área afetada em Portugal O nível reduzido de diversidade genética obtido entre os isolados portugueses do NMP, permite concluir que se trata de uma única introdução deste organismo em Portugal, e proveniente de uma região asiática. A inexistência de uma de correlação entre a variabilidade genética e a distribuição geográfica do NMP dentro da área afetada em Portugal, indica que o NMP se encontra distribuído de forma uniforme ao longo de toda a área afetada, provavelmente relacionado com a distribuição e a expansão natural do inseto vector. The pinewood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, has a wide distribution in North America, and is present throughout most of the territories of Canada and the United Stata. During the last century, this species has been transported by man to several non-native regions of the world, associated with trade and the global flow of forest products. Up to date, this invasive species has been reported from Asia (PR China, Japan, Korea and Taiwan) and more recently in Europe (Portugal). Due to the impact on native pine forests of these regions, this nematode species, the causal agent of pine wilt disease, is of great economic importance worldwide. In Portugal, the distribution of the PWN has been constrained to a relatively small area (500 000 ha) in the south of Lisbon (Setúbal Peninsula); however, it has become the most serious threat to pine forests in the country. Until recently, no consensus had emerged on the possible pathway of the PWN introduction in Portugal. Several hypotheses have been put forward to explain this introduction, such as an origin from endemic areas where the nematode naturally occurs (North America), or non-endemic areas where the nematode behaves as an exotic pest (East Asia). Random amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR) and satellite DNA (satDNA) techniques were used in order to assess the level of genetic variability and genetic relationships, among several isolates of the PWN, representative of the entire affected area in Portugal. In the case of RAPD-PCR, 24 Portuguese isolates, plus two additional isolates of B. xylophilus, representing North America and East Asia were included. B. mucronatus was used as an out-group. Twenty-eight random primers generated a total of 640 DNA fragments. With satDNA, 206 Mspl sequence repeats were obtained from 21 Portuguese isolates of B. xylophilus. Both molecular methods revealed a high genetic similarity among the Portuguese isolates, and the low level of genetic diversity strongly suggests that they were dispersed recently from a single introduction, and from East Asia. The lack of apparent relationship between the genetic variability and the geographic distribution of the PWN within the affected area, suggests that the recent introduction of this pest (and pathogen) in Portugal has been uniformly distributed since its establishment, probably following the natural distribution and expansion of the insect vector.

Análise de selecção de áreas de caça por uma população de francelho (Faco naumanni) na planície de Évora

Em Portugal, apesar de haver registos históricos da reprodução desta espécie um pouco por todo o país, o francelho (Falco naumanni, Fleischer 1818) desapareceu de quase todo o território nacional estando actualmente restrito à região do Alentejo. Em 2005, 80% da população encontrava-se nas ZPE´s de Castro Verde e Vale do Guadiana (62% e 18% da população nacional, respectivamente (Catry et al. 2005). Ao longo dos últimos anos têm vindo a ser desenvolvidos trabalhos de investigação com o objectivo de conhecer as necessidades ecológicas da espécie nas diferentes colónias, de forma a tentar conciliar a prática de uma agricultura economicamente viável com a conservação de uma espécie que está dependente das práticas agrícolas tradicionais. Os conflitos entre conservação e alteração das práticas agrícolas levam a desafios na gestão deste tipo de habitats. A população de francelho da ZPE Évora, após um período de 12 anos de ausência da espécie como reprodutora na região, tem vindo a aumentar em número de casais reprodutores, desde 1995. A distribuição da espécie na ZPE de Évora, a sua evolução e os principais factores que afectam a sua reprodução foram por nós estudados no ano de 2007. Foi ainda analisada a disponibilidade de habitat de caça para o francelho na área que envolve a principal colónia de Évora de modo a poderem ser sugeridas medidas de gestão adequadas à sua conservação. Concluiu-se que a manutenção de áreas de caça e a conservação dos locais de nidificação existentes e a criação de novos locais passa inevitavelmente pela sensibilização e informação dos proprietários sobre as medidas a aplicar. O recurso a instrumentos de financiamento neste sentido será primordial; ABSTRACT: In Portugal, although there are historical records of the reproduction of this species all over the country, the lesser kestrel (Falco naumanni) disappeared from almost all the national territory being currently restricted to the Alentejo region. In 2005, 80% of the population was in Castro Verde and Vale do Guadiana SPA (62% and 18% of the national population, respectively) (Catry et al. 2005). Over the past few years have been developed research in order to meet the ecological needs of the species in the different colonies, trying to reconcile the practice of an economically viable agriculture and the conservation of a species that is dependent on traditional farming practices. The conflicts between conservation and changing farming practices lead to challenges in managing this type of habitat. The lesser kestrel population of the Évora SPA, after a 12 year absence of the species as breeding in the region, has being increasing in the number of breeding pairs, since 1995. The distribution of the species in the SPA of Évora, its evolution and the main factors affecting their reproduction were studied in 2007. It was also analyzed the availability of hunting habitat for the kestrel in the area surrounding the main colony of Évora so that appropriate management measures can be suggested to their conservation. It was concluded that maintaining hunting areas and conservation of existing nesting sites and the creation of new local inevitably passes through the awareness and information of the owners on the measures to be implemented. The use of financial instruments and the in this direction will be paramount.

Turismo e Lugares: uma visão geográfica

Se por um lado, as últimas décadas do século XX consolidaram e globalizaram o fenómeno turístico, por outro criaram novos turistas e novos percursos, onde a ligação ao território se modifica. O presente artigo analisa, através de uma perspectiva geográfica, a importância do lugar para a actividade turística. As autoras utilizaram como suporte metodológico uma revisão bibliográfica, recorrendo a alguns exemplos práticos. Pretende-se mostrar como as novas práticas turísticas cativam novos públicos, reinventam os territórios, onde o lugar assume novos significados: pela singularidade; pela identidade; pela ligação afectiva e pelo modo como ele é vivido.

Algumas notas sobre o contributo do ensino superior para a qualificação da população no Alentejo

As instituições de ensino superior (IES), quando analisadas do ponto de vista da sua localização no território, produzem efeitos de natureza diversa: económico-financeira, de melhoria do ambiente urbano, de melhoria do capital humano, transferência de conhecimento entre as instituições de ensino superior e o tecido produtivo, entre outros. A frequência de ensino superior é entendida, na generalidade dos casos, pelos estudantes e pelas famílias, como um investimento. Um investimento numa vida melhor, decorrente, em boa medida, da capacidade de enfrentar com maior robustez o mercado de trabalho e obter melhores remunerações e, consequentemente, melhor qualidade de vida. Neste texto temos como objectivo discutir de que forma as IES localizadas no Alentejo têm vindo a promover a melhoria da qualificação da população da região. Não obstante o conhecimento poder ser produzido e transmitido no seio das IES entre docentes, investigadores e estudantes, mais determinante para o desenvolvimento territorial é a forma como ele chega às organizações da região. A conjuntura atual é, provavelmente, a mais difícil que as IES portuguesas conheceram desde a expansão do ensino superior iniciada na década de 80 do século XX. Por isso nos parece tão relevante, para o país e para o Alentejo em particular, conhecer como está estruturada a procura de ensino superior bem como de que forma as IES se têm mostrado relevantes na melhoria da qualificação da população.

Clínica de animais de companhia: uveítes caninas: estudo retrospetivo de 50 casos

O presente relatório pretende descrever as atividades desenvolvidas durante o estágio no Hospital Veterinário do Restelo e apresentar a casuística relativa a este período. É apresentado também um estudo de casos sobre uveítes caninas e monografia sobre o tema. A uveíte é uma das afeções oculares mais frequentes nos cães, muitas vezes associada a outras afeções sistémicas. Foi realizado um estudo retrospetivo com 50 cães que se apresentaram neste Hospital nos anos de 2011 e 2012 com diagnóstico primário de uveíte, com o objetivo de caracterizar a distribuição das uveítes na população canina e avaliar as suas causas, em especial a relação com doenças sistémicas. O número de causas oculares identificadas foi igual ao número de causas sistémicas, o que reforça o importante papel de determinadas afeções sistémicas na etiologia da uveíte; ### Abstract Clinic in Small Animals Canine Uveitis: Retrospective Study of 50 cases The present report aims to describe the activities developed during the traineeship in Veterinary Hospital of Restelo and presents the casuistry relating to this period. It also presents a case study about canine uveitis and a monograph about it. Uveitis is one of the most common ocular diseases in dogs, often associated with others systemic diseases. We conducted a retrospective study in 50 dogs presented at the Hospital in 2011 and 2012 with a primary diagnosis of uveitis, with the purpose of characterizing the distribution of uveitis in the dog population and evaluate their causes, in particularly the relationship with systemic diseases. The number of identified ocular causes was equal to the number of systemic causes, which reinforces the important role of certain systemic conditions in the etiology of uveitis.

Algumas Notas sobre o Contributo do Ensino Superior para a Qualificação da População do Alentejo

As instituições de ensino superior (IES), quando analisadas do ponto de vista da sua localização no território, produzem efeitos de natureza diversa: económico-financeira, de melhoria do ambiente urbano, de melhoria do capital humano, transferência de conhecimento entre as instituições de ensino superior e o tecido produtivo, entre outros. A frequência de ensino superior é entendida, na generalidade dos casos, pelos estudantes e pelas famílias, como um investimento. Um investimento numa vida melhor, decorrente, em boa medida, da capacidade de enfrentar com maior robustez o mercado de trabalho e obter melhores remunerações e, consequentemente, melhor qualidade de vida. Neste texto temos como objectivo discutir de que forma as IES localizadas no Alentejo têm vindo a promover a melhoria da qualificação da população da região. Não obstante o conhecimento poder ser produzido e transmitido no seio das IES entre docentes, investigadores e estudantes, mais determinante para o desenvolvimento territorial é a forma como ele chega às organizações da região. A conjuntura atual é, provavelmente, a mais difícil que as IES portuguesas conheceram desde a expansão do ensino superior iniciada na década de 80 do século XX. Por isso nos parece tão relevante, para o país e para o Alentejo em particular, conhecer como está estruturada a procura de ensino superior bem como de que forma as IES se têm mostrado relevantes na melhoria da qualificação da população.

Cartografia da oferta educativa e formativa destinada à população adulta do concelho de Vendas Novas na última década (2000 a 2010)

A presente dissertação constitui-se num estudo desenvolvido na área da educação de adultos, tendo como questão central: qual a oferta educativa e formativa certificada dirigida à população adulta do concelho de Vendas Novas, no período de 2000 a 2010? Procurámos dar resposta a esta questão, reflectindo sobre os conceitos relativos à Educação e Aprendizagem ao Longo da Vida e traçando uma breve retrospectiva das políticas educativas que nortearam este sector da educação. Atendendo à natureza do objecto em estudo, seguiu-se uma metodologia qualitativa, tendo a recolha de dados recaído sobre documentos oficiais produzidos por instâncias locais e regionais. Para a sua análise e interpretação, recorreu-se à técnica de análise de conteúdo, com o objectivo de destacar o seu conteúdo, quer evidente, quer latente. Os resultados emanados deste estudo permitiram-nos concluir efectivamente que as ofertas formativas colocadas ao dispor da população do concelho de Vendas Novas, durante a década de 2000 – 2010, foram muito diversificadas e procuraram, não só dar resposta às necessidades de formação/qualificação diagnosticadas, mas também dar cumprimento às orientações políticas nacionais e internacionais, em matéria de educação de adultos; ABSTRACT:This dissertation is the result of a study carries out in the area of adult education, having as central concern the mapping of the certified educational and training offer for adults in the county of Vendas Novas, in the period between 2000 and 2010. We tried to answer this question, reflecting on the concepts relating to education and lifelong learning and plotting a brief review of educational policies that guided this sector of education. Due to the nature of the subject under study, was followed a qualitative methodology, and data collection has relied on official documents produced by local and regional authorities. For the analysis and interpretation of data, we used the technique of content analysis, in order to highlight its content, either obvious or latent. The results emanating from this study allowed us to conclude that the provision of educational and training offer made available to the population of the county of Vendas Novas, during the decade 2000 - 2010, was very diverse and sought to address not only the training / qualification needs diagnosed, but also to comply with the national and international guidelines, in the field of adult education.

Evolução da população do fungo nematófago Pochonia chlamydosporia -isolado PcMR, após inoculação, no solo e na raiz do tomateiro cultivado em estufa

O fungo Pochonia chlamydospoia é um potencial agente de controlo biológico dos nemátodes-das-galhas-radiculares. Com este trabalho, pretendeu-se avaliar a eficácia de inoculações de clamidósporos no solo, no estabelecimento de uma população do fungo no solo e na raiz de tomateiro em estufa com níveis de densidade iguais ou superiores aos considerados como necessários para um eficaz controlo dos nematodes-das-galhas-radiculares. Ao longo de dois anos de ensaio, fórum efetuadas inoculações do isolado PcMR e avaliada a densidade de fungo no solo e na raiz, As inoculações efetuadas permitiram estabelecer uma população de P. chlamydosporia no solo e atingir os valores de densidade pretendidos. No entanto, os valores pretendidos para colonização da raiz pelo fungo foram atingidos apenas no primeiro ano. Foi igualmente demonstrada a capacidade do fungo em se manter no solo durante longos períodos de tempo mesmo na ausência de cultura e em condições adversas de humidade e temperatura. /ABSTRACT: Pochonia chlamydosporia is a potential root-knot nematode biological control agent. The aim of this work was to evaluate the effectiveness of chlamydospore inoculations at the soil, for the establishment at both soil and greenhouse tomato root, of a fungus population in density levels equal or superior to those considered as needed for an effective control of root-knot nematode. Along two years, several inoculations using the Portuguese isolate PcMR were made and the density of fungus at the soil and roots studied. These inoculations allowed the establishment of a population of P. chlamydosporia at the soil and achieve the desired density values. However, only in the first year of assay, the desired values of root colonization by fungus were achieved. lt was also demonstrated that P. chlamydosporia can survive for itself at the soil for a long period of time even in the absence of plant culture and in adverse moist and temperature conditions.