Extração de DNA de machos e fêmeas adultos de Haemonchus contortus.

2015

Triagem de hidrolases por metagenômica de solos agrícolas do Norte do Paraná.

Hidrolases englobam um grupo de enzimas que catalisam a quebra de ligações covalentes em reação com água; entre elas estão as proteases, amilases, lipases, pectinases, celulases e catalases. Essas enzimas são muito importantes, com ampla utilização na indústria em geral. O solo é um ambiente muito rico e diverso em microrganismos, sendo considerado a maior fonte para obtenção de substâncias, enzimas e antibióticos, por exemplo. Com a metagenômica, passou a ser possível acessar melhor esse potencial microbiano, permitindo a descoberta de novos genes e biomoléculas. Neste estudo foram coletadas amostras de solos (0-10 cm de profundidade) do norte do Paraná visando buscar hidrolases microbianas funcionais. Foi realizada a extração do DNA de um Latossolo Vermelho Eutroférrico sob quatro manejos de solo e de culturas distintos e as amostras foram submetidas ao sequenciamento utilizando a plataforma 454 (Applied Science). As sequências de DNA foram comparadas com o banco de dados não redundante (NR) do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) para busca de similaridade com proteases, amilases, lipases, pectinases, celulases e catalases. A partir do DNA total foram realizadas reações de PCR (Polymerase Chain Reaction) com primers degenerados direcionados para a amplificação de pectinases, celulases e lacases e os produtos de PCR foram purificados com Purelink kit (Invitrogen®) e sequenciados (ABI 3500xL, Aplied Biosystems®). A comparação com as sequências do NCBI e KEGG resultou na identificação de 1.137 sequências com grande similaridade com a enzima lacase; 16.883 sequências para celulase; 2.001 para pectinase; 1.006 para amilase; e 3.725 para lipase. Esses resultados mostram que esses solos agrícolas representam uma fonte importante de recursos biológicos para aplicação industrial, principalmente de enzimas celulases. Até o presente momento, o sequenciamento de 26 produtos amplificados por PCR apresentou identidade para uma amostra, que foi identificada como a enzima celulase.

Transferibilidade de locos microssatélites desenvolvidos em outras espécies de palmeiras para Astrocaryum vulgare Mart.

Astrocaryum vulgare Mart., conhecida por tucumã-do-Pará, possui uso popular na região amazônica e grandes potencialidades de aproveitamento em indústrias farmacêutica, cosmética e de biodiesel. A exploração ainda é extrativista, tornando fundamentais informações sobre a variabilidade genética existente em áreas de ocorrência natural. A variabilidade genética pode ser acessada por marcadores microssatélites ou SSR, considerados ideais para estudo em populações naturais. Entretanto, não há relatos de desenvolvimento de microssatélites para A. vulgare. O objetivo foi avaliar a transferibilidade de locos SSR desenvolvidos para outras espécies de palmeiras em A. vulgare. Realizou-se a extração de DNA a partir de amostras de folíolos de tucumanzeiros de sete povoamentos e após a quantificação os DNA?s foram submetidos à PCR, com os locos desenvolvidos para Bactris gasipaes, Phoenix dactylifera e Astrocaryum aculeatum. As condições de amplificação seguiram o protocolo desenvolvido para A. aculeatum, com pequenas adaptações. Os produtos amplificados foram aplicados em gel de agarose a 3,5%, corado com brometo de etídio e submetidos à eletroforese horizontal. Os perfis dos géis foram fotodocumentados e as imagens armazenadas digitalmente. A transferibilidade dos locos foi avaliada com base na amplificação dos produtos, sua nitidez e ausência de bandas inespecíficas. Todos os locos de A. aculeatum e a maioria dos de B. gasipaes amplificaram, com 75% deles transferíveis para o genoma de A. vulgare, enquanto que apenas dois dos locos de P. dactylifera amplificaram, com muitas bandas inespecíficas, mostrando-se inviáveis para estudos do genoma da espécie.

Fungos associados ao escurecimento da madeira em paricá.

O paricá (Schizolobium parahyba var. amazonicum (Huber ex Ducke) Barneby) é uma espécie de potencial madeireiro e alternativa para reflorestamento de recuperação de áreas degradadas. Sua ocorrência é restrita à Bacia Amazônica, no Brasil, Bolívia e Venezuela. No Brasil, ocorre em mata primária e secundária de terra-firme e várzea alta. Muitos fungos têm sido relatados causando doenças nesta cultura. Em amostras de madeira provenientes de plantios do município de Vigia-PA observou-se a presença de manchas escurecidas associadas à fungos. Assim, o trabalho teve como objetivo identificar os fungos associados ao escurecimento da madeira de paricá por meio de PCR, seguido do sequenciamento do DNA. Para isso, amostras de tecido doente de paricá foram plaqueados em ágar-água. Posteriormente, os fungos foram repicados para meio BDA e mantidos a temperatura ambiente. Foi realizada a extração de DNA para a realização do PCR utilizando os primers ITS4 e ITS5 e posteriormente o sequenciamento nucleotídico. Os produtos do PCR foram avaliados utilizando o programa Blastn, onde foi permitido apenas a identificação dos gêneros dos fungos Lasiodiplodia sp., Fusarium sp., Trichoderma sp. e Rhizoctonia sp. Outros dois fungos não foram identificados.

Identificação molecular de Groundnut ringspot virus em alface no município de Altamira.

A alface (Lactuca sativa L.), pertencente a família Asteracea, é uma das principais hortaliças folhosas cultivadas no Brasil. Em um cultivo de alface no município de Altamira, Estado do Pará, observou-se plantas apresentando manchas necróticas e bronzeamento das folhas, sintomas característicos de Tospovirus. O objetivo do trabalho foi identificar a espécie viral através dos testes de RT-PCR e sequenciamento do DNA. Para isso, amostras das plantas doentes foram levadas ao laboratório de fitopatologia da Embrapa Amazônia Oriental para realizar a extração do DNA e RT-PCR utilizando primers universais para o gênero Tospovirus (BR60/BR65). O produto do RT-PCR foi purificado e enviado para sequenciamento. As sequências foram avaliadas utilizando os programas Blastn, ClustalW e MEGA 7.0. Os isolados de alface provenientes do município de Altamira-PA foram identificados como Groundnut ringspot virus (GRSV).

RAPD em pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke): adaptação do método para coleta de amostras in situ, ajuste das condições de PCR e apresentação de um processo para selecionar bandas reprodutíveis.

Os objetivos deste trabalho foram: (1) validar um método para a coleta de material vegetal de pau-rosa; (2) selecionar um método para a extração de DNA de folhas de pau-rosa, em quantidade e com qualidade adequadas para a obtenção de padrões RAPD e (3) desenvolver e validar um critério, baseado no grau de reprodutibilidade para selecionar bandas RAPD para as análises genéticas.