Isolation and characterization of mesenchymal stem cells derived from bovine Wharton's jelly and their potential for use in cloning by nuclear transfer.

RESUMO: A geleia de Wharton é uma fonte de células tronco mesenquimais (CTMs) que ainda não havia sido testada para a produção de embriões bovinos por transferência nuclear (TN). O objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar e testar as CTMs derivadas da geleia de Wharton para produção de embriões e gestações por transferência nuclear em bovinos. O cordão umbilical foi coletado durante o nascimento e as células derivadas da geleia de Wharton (CGWs) foram isoladas por explante e cultivadas em Dulbecco?s Modified Eagle Medium. Fibroblastos (FB) da pele foram isolados após 6 meses de vida. As análises morfológicas foram realizadas pelas microscopias de campo claro e eletrônica de varredura durante o cultivo celular. Caracterização fenotípica e genotípica por citometria de fluxo, imunocitoquímica, RT-PCR e indução da diferenciação em linhagens celulares foi realizada com as CGWs. No procedimento de TN, ovócitos no estágio de metáfase II foram enucleados usando micromanipuladores, fusionados com CGWs ou FB e então ativados artificialmente. Micrografias de microscopia de varredura revelaram que CGWs tiveram forma variada sob cultivo. Os marcadores mesenquimais de CTMs (CD29+, CD73+, CD90+ and CD105+) foram expressos em cultura de CGWs bovina, como evidenciado por citometria de fluxo, imunocitoquímica e RT-PCR. Quando induzidas, estas células diferenciaram-se em osteócitos, condrócitos e adipócitos. Após classificação, as CGWs foram utilizadas na TN. A taxa de formação de blastocistos por TN com CGWs no sétimo dia de cultivo foi de 25,80±0,03%, similar a produção de blastócitos por TN com fibroblastos de pele (19,00±0,07). Gestações foram obtidas e mostraram que CGWs constituem um novo tipo celular para ser usado na clonagem animal. ABSTRACT: Wharton?s jelly is a source of mesenchymal stem cells (MSCs) that had not yet been tested for bovine embryo production by nuclear transfer (NT). Thus, the objective of this study was to isolate, characterize and test MSCs derived from Wharton?s jelly for embryo and pregnancy production by NT in cattle. The umbilical cord was collected during calving and cells derived from Wharton?s jelly (WJCs) were isolated by explant and cultured in Dulbecco?s Modified Eagle Medium. Skin Fibroblasts (FB) were isolated after 6 months of life. Morphological analysis was performed by bright field and scanning electron microscopy (SEM) during cell culture. Phenotypic and genotypic characterization by flow cytometry, immunocytochemistry, RT-PCR and differentiation induction in cell lineages were performed for WJC. In the NT procedure, oocytes at the arrested metaphase II stage were enucleated using micromanipulators, fused with WJCs or FB and later activated artificially. SEM micrographs revealed that WJCs have variable shape under culture. Mesenchymal markers of MSCs (CD29+, CD73+, CD90+ and CD105+) were expressed in bovine-derived WJC cultures, as evidenced by flow cytometry, immunocytochemistry and RT-PCR. When induced, these cells differentiated into osteocytes, chondrocytes and adipocytes. After classification, the WJCs were used in NT. Blastocyst formation rate by NT with WJCs at day 7 was 25.80±0.03%, similar to blatocyst rate with NT using skin fibroblasts (19.00±0.07%). Pregnancies were obtained and showed that WJCs constitute a new cell type for use in animal cloning.

Enraizamento, aclimatização e produção de mudas de pimenteira-do-reino (Piper nigrum L.) via micropropagação.

A pimenteira-do-reino (Piper nigrum L.) é uma planta trepadeira originária da Índia. Tem grande valor econômico, pois é uma especiaria utilizada mundialmente em grandes escalas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a percentagem de enraizamento, aclimatização e produção de mudas de pimenteira-do-reino. Para o enraizamento in vitro de pimenteira-do-reino, gemas apicais e nodais (explante) foram inoculadas em meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) suplementado com 0,05 mg L-1 de ANA. Para a aclimatização, as plantas de pimenteira-do-reino proveniente do cultivo in vitro foram transferidas para substrato vermiculita em bandeja de polipropileno com 24 células, com duas plantas por células. Após 30 dias, houve a transferência do material para substrato (terra+esterco+calcário). A taxa de sobrevivência dessas plantas na fase de aclimatização foi de 97%, relevante desempenho da estratégia adotada. Considerando que esta fase é uma das mais críticas da formação de mudas micropropagadas. Na formação de mudas a taxa de sobrevivência das plantas foi de 100%. A micropropagação é uma alternativa para obter mudas de pimenteira-do-reino com qualidade fitossanitária, sendo que o meio de enraizamento dos brotos é eficiente e promove alta taxa de sobrevivência na aclimatização em substrato vermiculita e todas as plantas desenvolvem para a formação de mudas.

Ácido naftaleno acético na rizogênese in vitro de pimenteira-do-reino (Piper nigrum L.).

O enraizamento in vitro é uma etapa importante no processo de micropropagação, por permitir a formação de plantas completas para posterior aclimatização às condições ex-vitro. Objetivou-se no trabalho verificar o efeito do ácido naftalenoacético (ANA) no enraizamento in vitro de dois híbridos de pimenteira-do reino, um proveniente do cruzamento entre Bento x Guajarina e o segundo do cruzamento entre Bragantina x Arborium. Foram usados os ápices caulinares e segmentos nodais com gemas laterais como explantes, inoculados em condições assépticas em frascos contendo 40 ml de meio básico de cultura de Murashige e Skoog (MS), sacarose a 3%, vitamina 0,2, phytagel a 0,2% e pH ajustado para 5,8 com dose de 0,05 mg L-1 ANA e o testemunha com ½ MS + 0 ANA para os dois genótipos. Ambos cultivados por seis semanas sob condições de fotoperíodo de 16 h.luz.dia-1, com intensidade luminosa de 3.000 lux e temperatura de 25 ± 3oC. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com 2 tratamentos e 5 repetições, sendo um frasco com cinco brotos por repetição. Os parâmetros avaliados foram: A percentagem de explante enraizados e o comprimento da raiz (mm) comprimento do broto (mm), número de raízes. Os dados foram submetidos à análise da variância. Pode-se concluir com os resultados que não há diferença significativa no desenvolvimento entre os dois híbridos a partir de brotos em meio 1/2 MS com 0,05 mg L-1 de ANA.

Indução à embriogênese somática por picloram no cultivo in vitro de embriões zigóticos de tucumã-do-pará (Astrocaryum vulgare Mart.).

O tucumã-do-pará (Astrocaryum vulgare Mart.) é uma palmeira oleaginosa que apresenta potencial para a indústria de biocombustíveis. Devido ao longo período de germinação das sementes, a obtenção de mudas em grande quantidade ainda não é possível pelos métodos tradicionais de propagação. Este trabalho objetivou o cultivo in vitro de embriões zigóticos de tucumã-do-pará excisados de frutos imaturos para a indução à embriogênese somática. Frutos imaturos foram coletados e, após o processamento, os embriões foram inoculados em meio de cultura MS com 4 concentrações de picloram: 0; 120; 240 e 360 M. Após 90 dias, verificaram-se porcentagens de viabilidade superiores a 80% para todos os tratamentos, indução de estruturas semelhantes à embriões somáticos superior a 50% em meio de cultura com picloram e maior crescimento do explante na concentração de 120 M, diâmetro médio superior aos demais. Houve somente formação de plântulas em meio de cultura livre de regulador de crescimento. O cultivo in vitro de embriões zigóticos de tucumã-do-pará é viável, gera plântulas após 90 dias de cultivo em meio de cultura sem regulador de crescimento e os embriões excisados de frutos imaturos são induzidos a estruturas semelhantes a embriões somáticos pela ação do picloram a partir de 120 ?M via embriogênese somática. O método de assepsia adotado propicia isenção total de contaminações.