Isolation and characterization of mesenchymal stem cells derived from bovine Wharton's jelly and their potential for use in cloning by nuclear transfer.

RESUMO: A geleia de Wharton é uma fonte de células tronco mesenquimais (CTMs) que ainda não havia sido testada para a produção de embriões bovinos por transferência nuclear (TN). O objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar e testar as CTMs derivadas da geleia de Wharton para produção de embriões e gestações por transferência nuclear em bovinos. O cordão umbilical foi coletado durante o nascimento e as células derivadas da geleia de Wharton (CGWs) foram isoladas por explante e cultivadas em Dulbecco?s Modified Eagle Medium. Fibroblastos (FB) da pele foram isolados após 6 meses de vida. As análises morfológicas foram realizadas pelas microscopias de campo claro e eletrônica de varredura durante o cultivo celular. Caracterização fenotípica e genotípica por citometria de fluxo, imunocitoquímica, RT-PCR e indução da diferenciação em linhagens celulares foi realizada com as CGWs. No procedimento de TN, ovócitos no estágio de metáfase II foram enucleados usando micromanipuladores, fusionados com CGWs ou FB e então ativados artificialmente. Micrografias de microscopia de varredura revelaram que CGWs tiveram forma variada sob cultivo. Os marcadores mesenquimais de CTMs (CD29+, CD73+, CD90+ and CD105+) foram expressos em cultura de CGWs bovina, como evidenciado por citometria de fluxo, imunocitoquímica e RT-PCR. Quando induzidas, estas células diferenciaram-se em osteócitos, condrócitos e adipócitos. Após classificação, as CGWs foram utilizadas na TN. A taxa de formação de blastocistos por TN com CGWs no sétimo dia de cultivo foi de 25,80±0,03%, similar a produção de blastócitos por TN com fibroblastos de pele (19,00±0,07). Gestações foram obtidas e mostraram que CGWs constituem um novo tipo celular para ser usado na clonagem animal. ABSTRACT: Wharton?s jelly is a source of mesenchymal stem cells (MSCs) that had not yet been tested for bovine embryo production by nuclear transfer (NT). Thus, the objective of this study was to isolate, characterize and test MSCs derived from Wharton?s jelly for embryo and pregnancy production by NT in cattle. The umbilical cord was collected during calving and cells derived from Wharton?s jelly (WJCs) were isolated by explant and cultured in Dulbecco?s Modified Eagle Medium. Skin Fibroblasts (FB) were isolated after 6 months of life. Morphological analysis was performed by bright field and scanning electron microscopy (SEM) during cell culture. Phenotypic and genotypic characterization by flow cytometry, immunocytochemistry, RT-PCR and differentiation induction in cell lineages were performed for WJC. In the NT procedure, oocytes at the arrested metaphase II stage were enucleated using micromanipulators, fused with WJCs or FB and later activated artificially. SEM micrographs revealed that WJCs have variable shape under culture. Mesenchymal markers of MSCs (CD29+, CD73+, CD90+ and CD105+) were expressed in bovine-derived WJC cultures, as evidenced by flow cytometry, immunocytochemistry and RT-PCR. When induced, these cells differentiated into osteocytes, chondrocytes and adipocytes. After classification, the WJCs were used in NT. Blastocyst formation rate by NT with WJCs at day 7 was 25.80±0.03%, similar to blatocyst rate with NT using skin fibroblasts (19.00±0.07%). Pregnancies were obtained and showed that WJCs constitute a new cell type for use in animal cloning.

Caracterização ambiental da microbacia do Córrego Espraiado.

A caracterização ambiental da microbacia estudada foi realizada com o objetivo de criar um conjunto de planos de informação (PI's), de modo a permitir um conhecimento apropriado do local pela equipe do projeto, o planejamento de atividades de pesquisa e a identificação de áreas de risco. A microbacia do Córrego Espraiado está localizada entre os municípios de Ribeirão Preto e Cravinhos. As informações básicas utilizadas na caracterização ambiental foram: I) conjunto de cartas planialtimétricas, escala 1:10.000 (IGC, 1992); II) mapa de solos, escala 1:25.000 (MIKLOS, 1996); III) imagem de satélite LANDSAT TM 5, passagem 01/09/93, bandas 3, 4 e 5. A partir destas informações foram gerados os planos: limite da microbacia, redes de drenagem e viária, modelo numérico de terreno (MNT), classes de declive, uso da terra (1995) e solos. Outros planos foram gerados a partir do cruzamento dos anteriores: potencial de infiltração e escoamento superficial da água, potencial natural de erosão, perdas de solo e expectativa de erosão. A versão do IDRISI utilizada foi a 4.1 (DOS). Para a entrada de dados vetoriais foi utilizado o TOSCA 2.12. Na geração dos mapas foi utilizado o COREL DRAW 4. Os planos foram exportados do IDRISI para o COREL DRAW no formato TIF. O limite da microbacia foi traçado sobre as cartas planialtimétricas e posteriormente digitalizado. Com este PI foi construída uma máscara, utilizada para extrair as células que não pertenciam à microbacia em vários procedimentos posteriores. As redes de drenagem e viária foram digitalizadas a partir das informações contidas nas cartas planialtimétricas e rasterizadas pelo módulo LINERAS, gerando os PI's correspondentes. As informações de altimetria passaram por processo semelhante ao anterior, porém na rasterização foi também usado o módulo POINTRAS. Posteriormente as informações de altimetria, já rasterizadas foram interpoladas de modo a preencher todas as células (módulo INTERCON), gerando o MNT da microbacia. Para eliminar os defeitos nas bordas da microbacia, foram também digitalizadas algumas informações de altitude fora do limite da microbacia. Finalmente, para excluir os resultados da interpolação, fora da área de interesse, foi utilizada a máscara realizando-se uma multiplicação entre planos, função presente no módulo OVERLAY. As classes de declive foram obtidas após o calculo da declividade por meio de função presente no módulo SURFECE e o MNT, resultando em um PI intermediário com os valores de declividade em cada célula. Então, utilizou-se o módulo RECLASS para agrupar as células em 7 classes. A imagem em "falsa cor" (composição colorida) foi obtida usando-se o módulo COMPOSIT e posteriormente registrada por meio do módulo RESAMPLE. As coordenadas UTM dos pontos de controle foram extraídos das cartas planialtimetricas. O PI-Uso Atual, foi obtido das informações também retiradas das cartas planialtimetricas, análise da imagem de satélite e de visitas ao campo, realizadas no ano de 1995. O arquivo vetorial produzido foi editado no TOSCA e os polígonos gerados, com o uso do módulo CYCLE. Finalmente o arquivo com os polígonos foi rasterizado (POLYRAS). O PI-Solos foi gerado da digitalização do mapa de solos semidetalhado produzido por MIKLOS (1996). Novamente foi utilizado o TOSCA, seguido dos módulos CYCLE e POLYRAS para produzir o arquivo matricial correspondente. O PI-Potencial de infiltração e Escoamento Superficial da Água foi obtido pelo cruzamento das informações de condutividade hidráulica dos solos e da declividade do terreno. Este PI e um passo intermediário de um método proposto para a identificação das áreas de risco de contaminação por agrotóxicos, apresentado em LUIS (1996) e GOMES (1996). Foram também gerados alguns PI's relacionados com o estudo de erosão na microbacia, utilizando a Equação Universal de Perdas de Solo - EUPS. O IDRISI forneceu os recursos necessários aos objetivos do trabalho. As principais deficiências encontradas são a interface homem/máquina e a criação dos polígonos com a TOSCA, onde há necessidade de informar para cada arco digitado os identificadores dos polígonos por ele dividido. Esta operação consome um esforço considerável e está sujeita a freqüentes erros.

Ação de formulações comerciais de Bacillus spp sobre lagartas de Grapholita molesta (Lepidoptera: Tortricidae).

Grapholita molesta é uma praga-chave em cultivos de macieira no sul do Brasil. Para controle de suas populações inúmeras intervenções com agrotóxicos são necessárias ao longo da safra. Neste estudo, objetivou-se avaliar a eficiência de formulações comerciais à base de Bacillus spp. no controle de lagartas de primeiro ínstar de G. molesta. O estudo foi realizado em delineamento experimental inteiramente casualizado com cinco tratamentos e cinco repetições: B. thuringiensis var. kurstaki (Dipel WG®); B. thuringiensis var. aizawai + kurstaki (Agree®); B. subtilis (Serenade®); B. pumilus (Sonata®) e uma testemunha (água). Cada tratamento foi alocado em uma microplaca contendo 24 células preenchidas com 0,67ml de dieta artificial e 12micronL da solução tratamento (em dose comercial) mais uma lagarta por célula. Os tratamentos foram mantidos em condições controladas e avaliada a mortalidade em 24, 48, 72 e 96 horas. As formulações de B. thuringiensis mostraram eficiência de controle superior aos demais tratamentos e não diferem entre si. Bacillus subtilis e B. pumilus evidenciaram controle da praga, porém, intermediário quando comparado à B. thuringiensis.