Análisis transcripcional de la vía de secreción y metabolismo del metanol durante la producción de una proteína heteróloga en Pichia pastoris

La levadura metilotrófica Pichia pastoris es de gran importancia industrial principalmente en la producción de proteínas heterólogas. En un estudio reciente se emplearon cinco factores ambientales para definir condiciones de cultivo a nivel de bioreactor que condujeron a altos (CM) y bajos (CP) niveles de la producción extracelular de una fitasa recombinante en una cepa Muts de P. pastoris. Los resultados de este estudio mostraron que bajo las condiciones CM, la demanda y consumo de O2 y de metanol fueron más altos y condujeron a valores más altos en la velocidad específica de crecimiento (μ), biomasa (2.7 veces), niveles de producción de fitasa extracelular (5.5 veces) y rendimientos (Yp/x) que en CP. Con el fin de comprender los mecanismos de regulación transcripcional que afectan a la fisiología de P. pastoris por la sobre-producción de la proteína recombinante y las condiciones de cultivo, en este trabajo se realizó un análisis de expresión diferencial de genes (DGE) empleando la tecnología de secuenciación masiva de mRNA (RNAseq) de la cepa Muts de P. pastoris crecida bajo las condiciones CM y CP reportadas previamente. Además se validaron los resultados del estudio de DGE mediante RT-qPCR. Resultados: La expresión de 4,950 genes, el 93% de los genes totales anotados, fueron detectados. Se sub- y sobre-expresaron 350 y 413 genes respectivamente en CM respecto a CP. En CM vs CP se sobre-expresaron significativamente términos relacionados con la biosíntesis de aminoácidos, biosíntesis de nucleósidos de purina, regulación de la traducción, glicosilación de proteínas y mitosis, indicando una mayor actividad anabólica en CM. La transcripción del gen heterólogo y de los genes de la ruta de desasimilación del metanol no mostraron diferencias entre ambas condiciones de cultivo y fue inducida en metanol. Sin embargo las enzimas claves (DAS1 y DAS2) de la ruta de asimilación del metanol se sobre-expresaron significativamente en CM vs CP, indicando que CM está favorecida la producción de biomasa y la generación de energía a través de esta vía, explicando los valores más altos para la μ y biomasa obtenidos en CM respecto a CP. De 110 genes analizados involucrados en la vía de secreción, 20 se sobre-expresaron en CM vs CP, la sobre-expresión de estos genes indicaron que bajo las condiciones de CM, se presenta una mayor actividad transcipcional de los genes implicados en el transporte y translocación hacia el RE (15%), genes implicados en el plegamiento de proteínas en RE (25%), así como genes relacionados en el procesamieto de las proteínas a través del RE (30%) y Golgi (35%) que permitieron un estado fisiológico favorable para la secreción de la proteína heteróloga. De los 44 genes relacionados con el estrés en RE durante la secreción, en CM vs CP se sobre-expresaron genes UPR indicando, que bajo condiciones de CM, se promueve la expresión de genes relacionados con el plegamiento de proteínas y probablemente se evita el acumulamiento de proteínas mal plegadas. La sub-expresión de todos los genes relacionados con autofagia, es uno de los factores que podría explicar la menor actividad proteolítica observada en CM. Finalmente se observó una correlación entre los métodos de RNA-seq y RTqPCR (r2=0.7). Conclusiones: El análisis de la DGE señala que los factores ambientales en CM condujeron a la regulación de la expresión de genes del proceso de secreción y genes relacionados al estrés en RE durante la secreción que condujeron a valores de Yp/x, más altos en CM que en CP y no se atribuyen a una expresión diferencial del gen heterólogo. La regulación de la ruta del metanol hacia la asimilación y una mejor respuesta de adaptación al estrés en CM condujeron a un mayor crecimiento y producción de biomasa en CM que en CP.

Proyecto de intervención social: reorientación de prácticas alimentarias en la familia

Este documento presenta un proyecto de intervención social denominado Reorientación de prácticas alimentarias en la familia bajo el modelo de intervención Centrado en la Tarea en las prácticas alimentarias de ocho familias, con el propósito de responder a la política de salud que se interesa en la prevención y tratamiento del problema creciente del sobrepeso y la obesidad de la población y a la política social en torno al bienestar familiar. Las familias participantes pertenecen al municipio de San Nicolás de los Garza Nuevo León y corresponden a cada una de ocho mujeres que previamente participaban en un proyecto de intervención social para su tratamiento en obesidad mórbida mediante un grupo de ayuda mutua. El documento concentra elementos teóricos, metodológicos y técnicos que permitieron la planeación y ejecución del proyecto de intervención, distribuidos en los distintos capítulos que se presentan a lo largo del documento. Se realizó una evaluación tanto inicial como final que incluyó instrumentos cuantitativos como: una Encuesta de Valor sobre Prácticas Alimentarias (EVSPA), datos como el peso corporal en kilogramos e Índice de Masa Corporal (IMC) y cualitativos como: grupo focal, grabación de los discursos en audio y fotografías de la familia al momento de cada intervención del proyecto. Los resultados obtenidos en el presente proyecto de intervención social se dividieron en relación a tres categorías obtenidas del análisis de la información y corresponden a: 1) Reconocimiento de los efectos de las prácticas alimentarias, 2) Habilidades desarrolladas en el proceso de alimentación y 3) Cooperación familiar. En cada una de ellas se pudieron observar cambios favorables en las familias que se reflejaron en el peso corporal de algunas de ellas. En conclusión, la intervención de nutrición desde el aspecto social de la familia generó una nueva forma de contribuir a la prevención y/o tratamiento del sobrepeso y obesidad. De la misma manera, cada una de las familias retomó acciones en relación a su proceso de alimentación sin la necesidad de un menú estructurado que generalmente limita el consumo de alimentos. Sin embargo, se requiere de mayor tiempo que el destinado en este proyecto para que la intervención logre mayores resultados y que las familias interioricen cada una de las prácticas alimentarias de forma positiva. Socialmente, el proyecto contribuyó a generar familias conscientes de su salud por medio de la alimentación y que al mismo tiempo actúen como promotores de prácticas alimentarias positivas en su entorno. De igual manera, el tener familias saludables impacta en una disminución de las estadísticas del sobrepeso y la obesidad que a largo plazo se traducen en un menor gasto en el sistema de salud.

El papel de la angiogénesis en la patogenia del actinomicetoma por nocardia brasiliensis

Objetivo: Investigar el papel de la angiogénesis durante el desarrollo del actinomicetoma y sobre el actinomicetoma establecido en un modelo experimental. Material y métodos: se determinó si el fenofibrato inhibe el crecimiento de la bacteria mediante la técnica de microdilución en placa. Se administró una suspensión de fenofibrato vía orogástrica cada 24 h durante el establecimiento del actinomicetoma y sobre el actinomicetoma establecido en ratones BALB/c infectados con la cepa N. brasiliensis HUJEG-1 (ATCC 700358). El tratamiento en ambos casos tuvo una duración de 45 días, tiempo en el que se evaluaron las diferencias en inflamación y la evolución clínica de las lesiones, empleando un vernier y la ecuación elipsoidea. También se realizó el análisis histológico en el sitio de la infección mediante tinciones con hematoxilina y eosina. El proceso de angiogénesis fue evaluado a diferentes tiempos en la administración del tratamiento mediante inmunohistoquímica, buscando como marcadores de vasos sanguíneos las moléculas VEGF, eNOS, y LYVE-1, este último como un marcador indirecto del proceso angiogénico. Resultados: se comprobó que el fenofibrato no inhibe el crecimiento de la bacteria a la concentración correspondiente a EC50 en ratones. Las lesiones características de la enfermedad se desarrollaron en un menor número de ratones que recibieron el tratamiento de fenofibrato, durante el establecimiento del actinomicetoma y sobre el actinomicetoma establecido. Además, se observó una disminución en las medidas de inflamación y en la aparición de lesiones histológicas, así como una disminución en el número de vasos sanguíneos en los sitios de la infección. Conclusiones: La angiogénesis contribuye a la patogenia del actinomicetoma por N. brasiliensis; la disminución de la formación de vasos sanguíneos por el tratamiento con fenofibrato limita el grado de la lesión.