Proteína C reactiva, marcador inflamatorio asociado con ANCA en tuberculosis pulmonar

Antecedentes: la proteína C reactiva es uno de los marcadores inflamatorios denominados “reactantes de fase aguda” que se produce en el hígado en respuesta a procesos infecciosos o inflamatorios. En los pacientes con tuberculosis se ha descrito la formación de anticuerpos anticitoplasma de neutrófi los (ANCA). Objetivo: determinar la concentración de proteína C reactiva, evaluar su comportamiento como marcador de la respuesta inflamatoria y analizar su correlación con los ANCA en los pacientes con tuberculosis pulmonar, antes y después de iniciar el tratamiento antifímico. Pacientes: se eligieron pacientes con sospecha de tuberculosis pulmonar. Una vez confirmado el diagnóstico, se obtuvieron las muestras de suero para analizar los datos clínicos y de laboratorios. La determinación de ANCA se realizó con estuches comerciales de inmunofluorescencia y la de proteína C reactiva con ELISA, antes y después de iniciar el tratamiento antifímico. Resultados: se obtuvieron 50 muestras de suero de pacientes con tuberculosis pulmonar. En la primera (94%) y segunda obtención (90%) de los sueros se registró un valor de proteína C reactiva menor de 5 mg/L. El valor promedio de proteína C reactiva fue de 3.05 ± 8.27 mg/L en la primera muestra y de 4.49 ± 11.2 mg/L en la segunda (p = 0.46). Los pacientes positivos a ANCA tuvieron valores más altos de proteína C reactiva en su segunda muestra (p = 0.001). Discusión: existe una asociación entre la proteína C reactiva y la producción de anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos en un subgrupo de pacientes con tuberculosis pulmonar. Su significación es incierta, pero quizá desempeñan alguna función patogénica en la respuesta inflamatoria pulmonar.

Análisis transcripcional de la vía de secreción y metabolismo del metanol durante la producción de una proteína heteróloga en Pichia pastoris

La levadura metilotrófica Pichia pastoris es de gran importancia industrial principalmente en la producción de proteínas heterólogas. En un estudio reciente se emplearon cinco factores ambientales para definir condiciones de cultivo a nivel de bioreactor que condujeron a altos (CM) y bajos (CP) niveles de la producción extracelular de una fitasa recombinante en una cepa Muts de P. pastoris. Los resultados de este estudio mostraron que bajo las condiciones CM, la demanda y consumo de O2 y de metanol fueron más altos y condujeron a valores más altos en la velocidad específica de crecimiento (μ), biomasa (2.7 veces), niveles de producción de fitasa extracelular (5.5 veces) y rendimientos (Yp/x) que en CP. Con el fin de comprender los mecanismos de regulación transcripcional que afectan a la fisiología de P. pastoris por la sobre-producción de la proteína recombinante y las condiciones de cultivo, en este trabajo se realizó un análisis de expresión diferencial de genes (DGE) empleando la tecnología de secuenciación masiva de mRNA (RNAseq) de la cepa Muts de P. pastoris crecida bajo las condiciones CM y CP reportadas previamente. Además se validaron los resultados del estudio de DGE mediante RT-qPCR. Resultados: La expresión de 4,950 genes, el 93% de los genes totales anotados, fueron detectados. Se sub- y sobre-expresaron 350 y 413 genes respectivamente en CM respecto a CP. En CM vs CP se sobre-expresaron significativamente términos relacionados con la biosíntesis de aminoácidos, biosíntesis de nucleósidos de purina, regulación de la traducción, glicosilación de proteínas y mitosis, indicando una mayor actividad anabólica en CM. La transcripción del gen heterólogo y de los genes de la ruta de desasimilación del metanol no mostraron diferencias entre ambas condiciones de cultivo y fue inducida en metanol. Sin embargo las enzimas claves (DAS1 y DAS2) de la ruta de asimilación del metanol se sobre-expresaron significativamente en CM vs CP, indicando que CM está favorecida la producción de biomasa y la generación de energía a través de esta vía, explicando los valores más altos para la μ y biomasa obtenidos en CM respecto a CP. De 110 genes analizados involucrados en la vía de secreción, 20 se sobre-expresaron en CM vs CP, la sobre-expresión de estos genes indicaron que bajo las condiciones de CM, se presenta una mayor actividad transcipcional de los genes implicados en el transporte y translocación hacia el RE (15%), genes implicados en el plegamiento de proteínas en RE (25%), así como genes relacionados en el procesamieto de las proteínas a través del RE (30%) y Golgi (35%) que permitieron un estado fisiológico favorable para la secreción de la proteína heteróloga. De los 44 genes relacionados con el estrés en RE durante la secreción, en CM vs CP se sobre-expresaron genes UPR indicando, que bajo condiciones de CM, se promueve la expresión de genes relacionados con el plegamiento de proteínas y probablemente se evita el acumulamiento de proteínas mal plegadas. La sub-expresión de todos los genes relacionados con autofagia, es uno de los factores que podría explicar la menor actividad proteolítica observada en CM. Finalmente se observó una correlación entre los métodos de RNA-seq y RTqPCR (r2=0.7). Conclusiones: El análisis de la DGE señala que los factores ambientales en CM condujeron a la regulación de la expresión de genes del proceso de secreción y genes relacionados al estrés en RE durante la secreción que condujeron a valores de Yp/x, más altos en CM que en CP y no se atribuyen a una expresión diferencial del gen heterólogo. La regulación de la ruta del metanol hacia la asimilación y una mejor respuesta de adaptación al estrés en CM condujeron a un mayor crecimiento y producción de biomasa en CM que en CP.