Evaluación de la expresión de enzimas hidrolíticas de pared celular en cloroplastos de tabaco

La alta capacidad del genoma del cloroplasto para integrar y expresar transgenes en altos niveles, hace de la tecnología transplastómica una buena opción para producir proteínas de interés. Este reporte presenta la expresión estable de una pectinasa (gen PelA), una β-glucosidasa (gen Bgl1), dos celulasas (genes CelA y CelB) y la primer expresión estable de una manganeso peroxidasa (gen MnP-2) en el genoma de cloroplastos de tabaco. Se construyeron seis vectores: pES4, pES5, pES6, pHM4, pHM5 y pHM6 derivados de pPRV111A conteniendo los genes sintéticos PelA, MnP- 2, Bgl1, CelA-CelB, CelA y CelB, respectivamente. Los genes se flanquearon por un promotor sintético del gen rrn16S y una secuencia sintética 3’UTR del gen rbcL. La integración en la región intergénica rrn16S y 3'rps12 se confirmó por análisis de Southern blot. El procesamiento estable de los transcritos se confirmó por un análisis de Northern blot. Se realizó un análisis enzimático para detectar la expresión y funcionalidad de las enzimas recombinantes, las plantas maduras mostraron mayor actividad comparado con plantas de tipo silvestre. Las plantas transplastómicas exhibieron 58.5% más actividad de pectinasa a pH neutro y a 60°C, mientras que manganeso peroxidasa mostró alta actividad a pH 6 y 65°C; en el caso de las celulasas, todas las enzimas mostraron mayor actividad a pH 5 (β-glucosidasa: 30.45 xviii U/mg, CelA-CelB 58 U/mg, CelA 49.10 U/mg y CelB 48.72 U/mg) a 40°C para β- glucosidasa y 65°C para celulasas. Las plantas transplastómicas mostraron un desarrollo similar a las plantas de tipo silvestre; sin embargo, la línea pHM4 mostró fenotipos variegados en hojas. Los análisis mostraron que los genes de enzimas hidrolíticas PelA, MnP-2, Bgl1, CelA-CelB, CelA y CelB pueden integrarse y expresarse en el genoma de cloroplastos con alta actividad; de este modo, debido a que una planta madura en promedio cuenta con ~ 470 g de biomasa, es posible producir 66,676.25 unidades de pectinasa, 21,715.46 unidades de manganeso peroxidasa, 338,081.0 unidades de celulasas A-B, 231,456.7 unidades de celulasa A, 206,669.8 unidades de celulasa B y 139,395.0 unidades de β-glucosidasa por planta. Este estudio sustenta información sobre métodos y estrategias de expresión de enzimas hidrolíticas con potencial aplicación biotecnológica utilizando plantas transplastómicas.

Respuesta a estrés iónico/Ph alcalino en ustilago maydis (Stevenson and Johnson, 1944) (ustilaginales, ustilaginaceae)

Todo organismo se enfrenta a condiciones desafiantes durante su desarrollo; variaciones de temperatura, humedad, presión osmótica y de pH, esta última condición se ve implicada en el grado de disponibilidad de nutrientes, entre ellos los metales, cuya solubilidad depende del pH del medio, por lo que la homeostasis de las concentraciones intracelulares de iones es fundamental para la fisiología de todo organismo vivo. El zinc forma parte estructural y es cofactor catalítico de numerosas enzimas y factores de transcripción, es por ello, que el transporte del metal está altamente regulado. Se han descrito transportadores de zinc y/o hierro pertenecientes a la familia ZIP, donde los principales representantes son Zrt1p y Zrt2p de alta y baja afinidad a zinc respectivamente, expresados ante condiciones limitantes de zinc en la levadura Saccharomyces cerevisiae. En el presente estudio fueron caracterizados 2 genes que codifican para transportadores de zinc en el hongo basidiomiceto Ustilago maydis; el gen codificado en el marco de lectura abierto um00096 corresponde a un transportador de alta afinidad a zinc, siendo ortólogo a ZRT1 de S. cerevisiae, mientras que el gen codificado en el marco um03110 presentó menor afinidad por el metal, nuestros resultados indican que pudiese ser transportador de otro metal. Mediante transcripción reversa y reacción en cadena de polimerasa punto final (RTPCR), se identificó que el factor de transcripción Rim101p participa en la regulación del gen ZRT2 de U. maydis, actuando como represor, en ambientes ácidos y limitantes de zinc, y como activador en pH neutro y bajas concentraciones de zinc.