Análisis transcripcional de la vía de secreción y metabolismo del metanol durante la producción de una proteína heteróloga en Pichia pastoris

La levadura metilotrófica Pichia pastoris es de gran importancia industrial principalmente en la producción de proteínas heterólogas. En un estudio reciente se emplearon cinco factores ambientales para definir condiciones de cultivo a nivel de bioreactor que condujeron a altos (CM) y bajos (CP) niveles de la producción extracelular de una fitasa recombinante en una cepa Muts de P. pastoris. Los resultados de este estudio mostraron que bajo las condiciones CM, la demanda y consumo de O2 y de metanol fueron más altos y condujeron a valores más altos en la velocidad específica de crecimiento (μ), biomasa (2.7 veces), niveles de producción de fitasa extracelular (5.5 veces) y rendimientos (Yp/x) que en CP. Con el fin de comprender los mecanismos de regulación transcripcional que afectan a la fisiología de P. pastoris por la sobre-producción de la proteína recombinante y las condiciones de cultivo, en este trabajo se realizó un análisis de expresión diferencial de genes (DGE) empleando la tecnología de secuenciación masiva de mRNA (RNAseq) de la cepa Muts de P. pastoris crecida bajo las condiciones CM y CP reportadas previamente. Además se validaron los resultados del estudio de DGE mediante RT-qPCR. Resultados: La expresión de 4,950 genes, el 93% de los genes totales anotados, fueron detectados. Se sub- y sobre-expresaron 350 y 413 genes respectivamente en CM respecto a CP. En CM vs CP se sobre-expresaron significativamente términos relacionados con la biosíntesis de aminoácidos, biosíntesis de nucleósidos de purina, regulación de la traducción, glicosilación de proteínas y mitosis, indicando una mayor actividad anabólica en CM. La transcripción del gen heterólogo y de los genes de la ruta de desasimilación del metanol no mostraron diferencias entre ambas condiciones de cultivo y fue inducida en metanol. Sin embargo las enzimas claves (DAS1 y DAS2) de la ruta de asimilación del metanol se sobre-expresaron significativamente en CM vs CP, indicando que CM está favorecida la producción de biomasa y la generación de energía a través de esta vía, explicando los valores más altos para la μ y biomasa obtenidos en CM respecto a CP. De 110 genes analizados involucrados en la vía de secreción, 20 se sobre-expresaron en CM vs CP, la sobre-expresión de estos genes indicaron que bajo las condiciones de CM, se presenta una mayor actividad transcipcional de los genes implicados en el transporte y translocación hacia el RE (15%), genes implicados en el plegamiento de proteínas en RE (25%), así como genes relacionados en el procesamieto de las proteínas a través del RE (30%) y Golgi (35%) que permitieron un estado fisiológico favorable para la secreción de la proteína heteróloga. De los 44 genes relacionados con el estrés en RE durante la secreción, en CM vs CP se sobre-expresaron genes UPR indicando, que bajo condiciones de CM, se promueve la expresión de genes relacionados con el plegamiento de proteínas y probablemente se evita el acumulamiento de proteínas mal plegadas. La sub-expresión de todos los genes relacionados con autofagia, es uno de los factores que podría explicar la menor actividad proteolítica observada en CM. Finalmente se observó una correlación entre los métodos de RNA-seq y RTqPCR (r2=0.7). Conclusiones: El análisis de la DGE señala que los factores ambientales en CM condujeron a la regulación de la expresión de genes del proceso de secreción y genes relacionados al estrés en RE durante la secreción que condujeron a valores de Yp/x, más altos en CM que en CP y no se atribuyen a una expresión diferencial del gen heterólogo. La regulación de la ruta del metanol hacia la asimilación y una mejor respuesta de adaptación al estrés en CM condujeron a un mayor crecimiento y producción de biomasa en CM que en CP.

Producción y caracterización de la superóxido dismutasa a (SodA) de nocardia brasiliensis en pichia pastoris

Introducción: A mediados de los años 70’s del siglo pasado el descubrimiento de la tecnología del ADN recombinante marca el inicio de la era de la biotecnología moderna. La implementación de estas tecnologías permitió la utilización de organismos como sistemas de expresión que a lo largo de los años ha generado la producción de una gran variedad de productos biológicos. Dentro de estos sistemas Pichia pastoris es un sistema de expresión ampliamente utilizado debido a sus características tales como la producción de proteínas en grandes cantidades, la liberación de los productos al medio de cultivo, la obtención de productos complejos que requieren modificaciones postraduccionales típicas de los eucariotas o que contienen puentes disulfuro, entre otras. Nocardia brasiliensis es una bacteria parcialmente ácido-alcohol resistente la cual forma colonias granulares, con hifas aéreas escasas, sus colonias exhiben un color anaranjado pardo con bordes en blanco. N. brasiliensis es patógena para el ser humano y es el agente causal del actinomicetoma. El actinomicetoma es una enfermedad crónica generalmente localizada en las extremidades. Se caracteriza por ser un proceso lento de tumefacción con nódulos, abscesos y fístulas.La Superóxido Dismutasa (SOD) es una enzima reductora polimérica que cataliza la conversión del ión superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular. La SOD ha sido propuesta como un factor de virulencia de microorganismos patógenos, cuya acción consiste en bloquear los efectores oxidativos del estallido respiratorio iniciado por los fagocítos en el fagolisosoma. Este mecanismo ha sido descrito para bacterias de los géneros Mycobacterium, Rhodococcus y Nocardia. Objetivo: producir y caracterizar la Superóxido Dismutasa A (SODA) de Nocardia brasiliensis en Pichia pastoris. Metodología: se realizó el diseño de primers adicionando secuencias de sitios de corte para las enzimas XhoI y AvrII, así como una cola de histidinas en el extremo 5’ para la amplificación del gen sodA de N. brasiliensis a partir del ADN genómico de Nocardia brasiliensis. El amplicón se clonó en el vector de expresión pPIC9. Se llevó a cabo la transformación por electroporación de levaduras Pichia pastoris GS115. La producción de SOD se llevó a cabo en inducciones de 96 h con metanol como agente inductor. Los sobrenadantes se dializaron con membranas de celulosa. Los dializados se observaron por SDS-PAGE y western blot. Se analizó la actividad funcional de la enzima con el SOD Assay kit de Sigma Aldrich. Resultados: Por reacción en cadena de la polimerasa se obtuvo una secuencia de 625 pb correspondiente al gen sodA. El fragmento se ligó al vector de expresión pPIC9 y fue caracterizado con las enzimas de restricción XhoI y AvrII. Las cepas trasformadas de P. pastoris GS115 se caracterizaron con el gen aox1 obteniendo cepas Mut+ y Muts. Los análisis por SDSPAGE mostraron bandas no observadas en el control negativo de expresión mientras en los western blot solo una de las clonas mostró señal. Los análisis de actividad funcional sugieren inhibición de la reacción enzimática infiriendo presencia de la proteína SOD en el medio dializado. Conclusiones: Se logró la construcción del sistema de expresión Pichia pastoris con el casete de expresión de la SOD de N. brasiliensis. Así como la generación de cepas Mut+y Muts. En los ensayos de actividad funcional se observó inhibición de la reacción enzimática.

Evaluación de la actividad amebicida en trofozoitos de entamoeba histolytica (Schaudinn, 1903) de 15 plantas medicinales usadas en el Noreste de México

La amibiasis es una de las enfermedades parasitarias de mayor importancia en países subdesarrollados con climas tropicales y subtropicales, siendo México un país en el cual los datos epidemiológicos demuestran que el 20 % de la población se encuentra infectada por el protozoario Entamoeba histolytica. La principal quimioterapia para esta enfermedad se basa en el uso de imidazoles principalmente del Metronidazol el cual es la causa de numerosos efectos secundarios producidos tras su administración, por lo que es necesario obtener nuevos compuestos antiprotozoarios que ayuden a lograr mejores tratamientos. La medicina tradicional usada en el noreste de México menciona el empleo de numerosas plantas las cuales pueden ser empleadas para el tratamientos de desórdenes intestinales provocados por parásitos tanto protozoarios como helmintos. El objetivo de la presente investigación fue evaluar la actividad amebicida de 15 plantas medicinales empleadas en la medicina tradicional mexicana y aislar e identificar los compuestos con la principal actividad amebicida del extracto de la planta que presente el mayor porcentaje de inhibición sobre el crecimiento del parásito. Ruta chalepensis fue la planta con el mayor porcentaje de inhibición, se utilizaron 660 g de hojas de R. chalepensis los cuales fueron sometidos a extracción Soxhlet empleando metanol como solvente de extracción; después de eliminar el solvente, se evaluó la actividad amebicida del extracto metanólico y de sus particiones hexánica y de acetato de etilo. El extracto metanólico mostró una actividad amebicida de 90.50 % a 150 g/ml, en tanto la partición hexánica fue de 93.47 % y la partición de acetato de etilo de 84.82 % las cuales fueron evaluadas a la misma concentración de 150 g/ml, debido a que se obtuvieron porcentajes de inhibición sobresaliente en las dos particiones se realizó la separación cromatográfica de los componentes de ambas particiones. Del fraccionamiento cromatográfico se identificaron mediante diversas técnicas de RMN y espectrometría de masas los siguientes compuestos, una mezcla de psoraleno y bergapteno (IC50 de 57.09 g/ml), una mezcla de xantotoxina-isopimpinelina (IC50 de 26.22 g/ml), chalepensina (IC50 de 38.71 g/ml), graveolina, rutamarina (IC50 de 6.54 g/ml) y chalepina (IC50 de 28.67 g/ml). Como es posible observar el efecto amebicida de R. chalepensis está respaldado por la presencia de furanocumarinas.