Efecto de la terapia autóloga con linfocitos T CD8+ estimulados con antígeno tumoral total E IL-21 en caninos con tumor venéreo transmisible

La Organización Mundial de la Salud declaro que el cáncer es una de las principales causas de muerte en el mundo, para el 2012 se presentó un total de 8.2 millones de defunciones. A pesar de la gran cantidad de recursos invertidos en investigación, la tasa de mortalidad no ha sido disminuida, por lo tanto es necesario el desarrollo de nuevas terapias efectivas contra el cáncer. Desde sus inicios, en el campo de la inmunoterapia se han realizado numerosos ensayos en humanos con cáncer y en modelos animales, obteniendo algunos casos de regresión tumoral completa. En el presente trabajo se evaluó el efecto de la terapia autóloga en perros inoculados experimentalmente con Tumor Venéreo Transmisible (TVT). Se inoculó12 hembras de raza mixta con TVT (1x108 células) intragenital, una vez que el tumor alcanzo un volumen de 10cm 3 , se colectó una biopsia con la cual se extrajo el antígeno tumoral total (300 µg/mL) el cual fue agregado (30µg/mL) en cultivos de células dendríticas inmaduras. Linfocitos totales obtenidos del mismo paciente y CPAs (CD80+ 80.3%, CD83+ 76.4%, DLA II 86.5%) cargadas con antígeno tumoral fueron co-cultivados en presencia de estímulos con IL-21 (50ng/mL) o IL-2 (20ng/mL), posterior a la activación de los linfocitos (746.88 pg/mL IFNȖ), las células T CD8+ específicos de tumor fueron separadas por selección negativa (Dynabeads Untouched) con un 82.6% de pureza para finalmente ser expandidas con OKT3. Se llevó a cabo un ensayo de in vitro de la citotoxicidad de los Linfocitos T CD8+ específicos de tumor contra las células de TVT, obteniendo 100% de lisis de la célula tumoral cultivada en presencia de linfocitos CD8+ específicos de tumor estimulados con IL-21 y un 90% de citotoxicidad tumoral cuando los CD8+ fueron específicos pero estimulados con IL-2, cuando los CD8+ no fueron específicos de tumor el porcentaje de citotoxicidad fue muy poco (10%). In vivo el grupo 1 fue tratado con terapia autóloga, linfocitos T CD8+ (5x107 célulaspor ciclo) específicos de tumor estimulados con IL-21 y aplicados en 3 ciclos en intervalos de 2 semanas. Como grupos control se utilizaron perros con tumor sin tratamiento (grupo 2), perros con tumor tratados con suero glucosado (grupo 3) y perros con tumor tratados con transfusión sanguínea autóloga (grupo 4). Después de la terapia autóloga la inmunidad celular (CD4+ y CD8+ ) e IFNȖ fue incrementada observando regresión tumoral en los perros del grupo 1. Estos resultados indican que la terapia autóloga es eficaz en la destrucción del TVT.

Expresión de FOXP3 en células de melanoma murino como un mecanismo de evasión de la respuesta inmune tumoral

Foxp3 es un marcador clave para identificación y función células T reguladoras, además su expresión se ha observado en diferentes líneas celulares de cáncer. El objetivo de este estudio fue determinar si la expresión de Foxp3 en células de melanoma murino actúa como un mecanismo de evasión de la respuesta inmune tumoral, modificando citocinas involucradas en la fase de inmunoedición de cáncer y promoviendo la generación de células Treg. En este estudio se determinó por primera vez la expresión de Foxp3 en las células melanoma murino B16F10 wt, y diseñamos RNA de interferencia en contra de Foxp3, además de analizar la expresión de CD25 y producción de IL-2, INF-γ, TGF-β e IL-10 para determinar su papel in vitro. Para la evaluación del efecto de Foxp3 durante el desarrollo tumoral in vivo, se estableció una línea celular con silenciamiento de Foxp3 la cuál identificamos como B16F10.DMH1 y se montaron dos modelos de melanoma murino, uno inducido con células B16F10 wt y otro inducido con células B16F10.DMH1, y se analizó progresión tumoral, producción de citocinas, expresión de CD25, Foxp3 y poblaciones celulares CD4+ , CD4+CD25+ y CD4+CD25+ Foxp3+ en TIL’s y células de bazo. Nuestros resultados in vitro demuestran que las células B16F10 wt expresan Foxp3 a nivel de RNAm y proteína, y su localización celular es principalmente perinuclear, además se encontró que estas células expresan CD25, y una producción de citocinas del tipo INF-γ, TGF-β, IL-10 e IL-2. Se encontró que la expresión de Foxp3 afecta la proliferación en células B16F10, encontrando una correlación positiva entre la expresión de Foxp3, CD25 e IL-2. In vivo, el silenciamiento de Foxp3 en las células B16F10.DMH1 afectó el desarrollo del melanoma incrementando el tiempo de aparición de tumor, sobrevida y disminuyendo el peso de los tumores, encontrando una correlación positiva entre Foxp3, CD25, IL-2 e IL-10 y negativa con la producción de IFN-γ, además se determinó que Foxp3 intratumoral está correlacionado con la expresión y presencia de células Treg con fenotipo CD4+CD25+ Foxp3+ en el microambiente tumoral y con una disminución de células T CD4+ a nivel periférico, sin afectar a linfocitos T activados (CD4+CD25+ ). Estos datos sugieren que Foxp3, participa en el desarrollo de la tumorogénesis en melanoma murino in vitro e in vivo, con la capacidad de modular a citocinas, moléculas involucradas en el desarrollo tumoral, así como poblaciones celulares con fenotipo regulador en el tumor, pero no en periferia.

Rebanadas de tumor mamario como sistema multicelular para la búsqueda de compuestos con potencial antineoplásico

El cáncer de mama sigue siendo una de las principales causas de muerte en mujeres en el mundo. Actualmente, la búsqueda de compuestos nuevos con actividad antitumoral, con menos efectos adversos y el desarrollo de métodos para evaluar su toxicidad es un área de intensa investigación. En este estudio se implementó la preparación y el cultivo de explantes de tumor mamario, los cuales fueron obtenidos a partir de rebanadas de tejido tumoral. Para validar el modelo se analizó el efecto del antineoplásico paclitaxel a diferentes concentraciones y posteriormente se seleccionó la concentración de 20 μg/mol para utilizarlo como control de referencia al evaluar la actividad del ácido cafeico, ácido ursólico y ácido rosmarínico, los cuales son compuestos que han sido identificados en productos naturales como agentes quimiopreventivos, antioxidantes e inhiben el crecimiento de algunas líneas celulares de cáncer de mama. A partir de muestras de cáncer de mama se prepararon rebanadas de tejido utilizando los rebanadores de tejidos Krumdieck® y Brendel-Vitron®; de estas rebanadas, se obtuvieron explantes de 4 mm y se incubaron con los compuestos seleccionados. La viabilidad se analizó por los ensayos de Azul Alamar, liberación de LDH, y criterios histopatológicos. Los resultados mostraron que la viabilidad de los explantes cultivados en presencia de paclitaxel (control positivo) disminuyó significativamente (

Inmunoterapia autóloga con células dendríticas en modelos caninos con tumor venéreo transmisible

La inmunoterapia autóloga utiliza células del mismo cuerpo para estimular y restaurar las defensas naturales del sistema inmunológico. Algunas de las células que han sido utilizado en años recientes son: linfocitos infiltrantes de tumor, linfocitos T citotóxicos, células asesinas activadas por linfocinas y células dendríticas (CD). Las CD son células especializadas y su función es el capturar, procesar y presentar antígenos a los linfocitos para iniciar una respuesta inmune. El tumor venéreo transmisible (TVT), también conocido como sarcoma infeccioso o tumor de Sticker, es un cáncer transmisible en perros que afecta mayormente los genitales externos y se transmite durante el coito. En este trabajo se implementó por primera vez un modelo de TVT en el órgano genital (vagina) de los pacientes y se les administró la inmunoterapia autóloga con CD específicas contra el tumor. Para estudiar esta terapia se utilizaron tres grupos experimentales: el tumor sin tratamiento, el tumor tratado con sangre completa autóloga, y el tumor tratado con CD autólogas específicas para el TVT. Por último se evaluó la capacidad inmunológica del extracto tumoral total (ETT) del tumor como método de prevención in vivo. Para el tratamiento autólogo con las CD, se esperó que el tumor midiese 3cm, se realizó un cultivo primario de las células de TVT y se les extrajo el 4% de su peso corporal de sangre a los pacientes para realizar una diferenciación de los monocitos a CD. Para evaluar el efecto de la inmunoterapia autóloga con CD se observaron los efectos secundarios, el tamaño tumoral, las poblaciones de linfocitos, los niveles de IFN-γ en sangre y los linfocitos infiltrantes de tumor por histopatología. Los monocitos se diferenciaron a CD y se les realizó un análisis fenotípico mediante citometría de flujo. Los monocitos mostraron una expresión de CD14+ de 80.1%, CD80+ de 15.6%, CD83+ de 0.4% y un DLA II de1.8%. En las CD se obtuvo una expresión de 8.7% para CD14+, 80.3% para CD80+, 76.4% para CD83+ y 86.5% para DLA II y 62% en la prueba de fagocitosis. La terapia no mostró ningún efecto secundario en nuestro grupo experimental y hubo una regresión tumoral del 100% para la semana doce. Se encontró un aumento de expresión celular en sangre de CD4+ de 29%, de CD8+ de 34% y de IFN-γ de 120 pg/mL. Nuestros resultados demuestran que la inmunoterapia autóloga con CD específicas inducen una regresión del TVT en caninos.

Rastreo de mutaciones para la detección del cáncer de ovario

Introducción. La Secretaría de Salud enfoca sus campañas de prevención y diagnóstico oportuno de cánceres ginecológicos a los tumores de mama y cervicouterino, dejando un poco en el olvido a los de endometrio y ovario. Estos dos últimos comienzan a reclamar atención debido a la falta de métodos certeros de diagnóstico. Es por ello que el presente trabajo pretende sentar las bases para el desarrollo de una futura prueba de diagnóstico molecular utilizando el Papanicolaou en base líquida; este ambicioso enfoque toma como punto de partida la descripción de las variantes genéticas presentes en población mexicana, pues a la fecha no existe un estudio que muestre este conocimiento genético. Los genes BRCA1/2 son genes cuyas mutaciones emblemáticas están presentes en el desarrollo del cáncer de ovario y que se toma como un punto de partida para los siguientes análisis de secuenciación de nueva generación. Materiales y Métodos. Al ser un primer aporte de esta nueva línea de investigación, el proyectó contempló la recolección de tumores en muestras de tejido embebido en parafina, tanto provenientes del ovario como del endometrio. Además, inició con el reclutamiento de pacientes con alguna de éstas dos neoplasias a las cuales se les solicitó una muestra de sangre, Papanicolaou en base líquida y biopsia de tejido tumoral. A todas las muestras se les realizó la extracción de su ADN para su ingresó al Biobanco Piloto Institucional y posteriormente se realizaron estudios de secuenciación de nueva generación utilizando la plataforma Illumina y teniendo como blanco de estudio a los genes BRCA1/2. Únicamente se secuenció el ADN proveniente de los tumores de ovario. Resultados. Se aportaron 50 muestras de tumores de ovario y 60 muestras de tumores de endometrio, así como cinco pacientes con cáncer de ovario y seis con cáncer de endometrio de los que, además del tumor, se obtuvo una muestra de su sangre y una más de Papanicolaou en base líquida. El análisis bioinformático de la secuenciación arrojó la presencia de 174 variantes distribuidas en 48 de las 50 muestras analizadas; 70 variantes habían sido reportadas previamente y el resto fue reportado por vez primera. Destacaron ocho variantes patogénicas (rs80356862, rs80358027, rs80358981, rs80357219 y rs80357260 en BRCA1, y rs80358557 y rs80359775 en BRCA2) y una muestra portadora de 70 variantes (tres de ellas patogénicas) las cuales comprometen la función de las proteínas producidas. Conclusión: El presente trabajo aportó una colección debidamente resguardada de tumores de ovario y otra de endometrio. En la colección de aquellos tumores de ovario se logró describir las variantes polimórficas presentes en los genes BRCA1/2, siendo el primer estudio de este tipo en la República Mexicana. El conocimiento aquí generado coloca las bases para la búsqueda de aquellas averías genéticas emblemáticas de este tumores, en pro del futuro desarrollo de una prueba de diagnóstico molecular para su detección oportuna.

Evaluación del efecto antitumoral de una fusoquina compuesta por ip10 y linfotactina en un modelo murino de cáncer de cérvix

El término “fusoquina” se utiliza para denominar a las proteínas de fusión compuestas por dos diferentes citocinas. Las citocinas son una familia de proteínas y glicoproteínas solubles que controlan la activación, proliferación e incluso la muerte celular programada de células del sistema inmune. Debido a su participación natural como inmunomoduladores se ha investigado su importancia en la regulación de microambiente tumoral. Dos de las quimiocinas que se han estudiado son IP10 y linfotactina. En nuestro equipo de trabajo se construyó previamente un vector adenoviral que expresa la fusión de estas quimiocinas. Por lo que el propósito de este trabajo fue evaluar el efecto antitumoral y antiangiogénico de este adenovirus. Para esto se produjeron las partículas virales a gran escala, se purificaron y cuantificaron por el método de punto final en placa. El modelo in vivo que se utilizó fue la cepa de ratón C57BL/6 y la línea tumoral de pulmón TC-1. Para determinar si el Ad-FIL incrementa el efecto antitumoral de la vacuna de DNA CRT/E7, los ratones fueron sensibilizados con ésta vacuna y posteriormente se les administraron los tratamientos Ad-Vacío, Ad-IP10, Ad-LPTN, Ad-IP10 + Ad-LPTN o Ad-FIL. Para le evaluación del efecto antiangiogénico los ratones fueron sacrificados y se obtuvieron los tumores, estos fueron procesados por la técnica histológica y se llevó a cabo una inmunohistoquímica para el marcador de vasos CD31. Finalmente se realizó un ensayo antitumoral empleando las mismas construcciones en un contexto de vacunas de DNA, para esto se emplearon dos grupos de ratones, uno de los grupos de ratones recibieron ambas vacunas de DNA (CRT/E7 + quimiocinas) mientras que el otro grupo de ratones recibieron solamente las quimocinas. La fusoquina FIL compuesta por IP10 y Linfotactina no presentó efecto antitumoral en el modelo estudiado; sin embargo, si presentó un efecto antiangiogénico significativo. Se deberá estudiar esta fusoquina en otros modelos y condiciones para continuar evaluando su efecto biológico, así como su utilidad al administrarla en combinación con otros tratamientos.

Evaluación del efecto citopático inducido por un adenovirus oncolítico en una línea celular murina utilizada como modelo de cáncer cervical

Los adenovirus oncolífticos ofrecen un tratamiento muy prometedor para combatir al cáncer. Estos virus se replican pobremente en células de ratón, por lo que para evaluar su eficacia para destruir tumores, usualmente se implantan células tumorales humanas en las cuales se replican los virus, pero con el inconveniente que se deben usar ratones inmunosuprimidos, para evitar que su sistema inmune elimine estas células por ser de diferente especie. Sin embargo, estos ratones no representan un modelo adecuado para evaluar la eficacia terapéutica de dichos adenovirus en ensayos preclfnicos, ya que carecen de mecanismos de defensa propios del sistema inmune que pudiesen coadyuvar en la protección contra el tumor y/o eliminación del adenovirus. Actualmente no existe un modelo de cáncer de cervix en ratones silvestres (inmunocompetentes) en los cuales los tumores se desarrollen a partir de celulas murinas y que los virus oncolfticos se repliquen eficientemente, al igual que en las células humanas, y se permita evaluar su efecto antitumoral. Se ha demostrado que los genes E6 y E7 del HPV-16 facilitan la replicación de los adenovirus. En este trabajo por primera vez se evalu6 1a capacidad de replicación de un adenovirus oncolftico en Ia lfrrea celular murina TC-1 Ia cual posee los genes E6 y E7 del HPV-16. Demostramos que el adenovirus oncolitico Adhz60 indujo en Ia lfnea TC-1 un efecto citopatico evidente, disminuye importantemente su viabilidad celular, indujo la expresión de proteínas virales tempranas y tardas, fue capaz de generar una progenie viral infectiva y de inducir apoptosis. Contribuciones y Conclusiones. Con nuestros resultados demostramos que la linea celular murina TC-1 es permisiva para la replican del virus oncolftico Adhz60. Por lo tanto, las células TC-1 pueden ser usadas como modelo tumoral para evaluar adenovirus oncoliticos en ratones inmunocompetentes.

Construcción y evaluación de un promotor eucariótico que controla la expresión de genes heterólogos en condiciones de hipoxia

La hipoxia es una característica común en los tumores sólidos, contribuyendo local y sistémicamente a la progresión tumoral, además de la falta de respuesta a la radioterapia y quimioterapia. La presencia de regiones hipóxicas en neoplasias malignas es uno de los factores predictivos más importantes, debido a que induce una amplia gama de respuestas fisiológicas y desempeña un papel crucial en la patogénesis de varias enfermedades humanas. Paradójicamente la hipoxia también es un blanco terapéutico atractivo ya que se produce hipoxia severa solo en el tejido del tumor sólido. El sistema de regulación HRE/HIF1 es común en todas las células de mamíferos y tejidos humanos, se puede utilizar para lograr la expresión selectiva de genes terapéuticos en condiciones de hipoxia. Cuando HREs derivados de diferentes genes se colocan en plásmidos y sistemas de vectores virales, confieren inducibilidad hipóxica sobre los promotores heterólogos en varios tipos de células por lo que la hipoxia puede ser explotada para el tratamiento de cáncer selectivo. En el presente trabajo se creó y caracterizó el vector hipóxico pHRE-Luc y se comprobó su funcionalidad en la línea celular B16F10 mediante la medición de la expresión génica del gen reportero luciferasa en condiciones de hipoxia y normoxia bajo la influencia de 6 copias de elementos sensible a la hipoxia (HRE) del gen de la eritropoyetina (Epo). Los resultados muestran que en condiciones de hipoxia, el vector pHRE-Luc (6HRE-Luc) fue 4 veces más eficiente que en normoxia para inducir la expresión génica. Este vehículo proporciona las bases para plantear un sistema sitio dirigido a las regiones hipóxicas de los tumores para terapia génica específica del cáncer.