Evaluación de la expresión de enzimas hidrolíticas de pared celular en cloroplastos de tabaco

La alta capacidad del genoma del cloroplasto para integrar y expresar transgenes en altos niveles, hace de la tecnología transplastómica una buena opción para producir proteínas de interés. Este reporte presenta la expresión estable de una pectinasa (gen PelA), una β-glucosidasa (gen Bgl1), dos celulasas (genes CelA y CelB) y la primer expresión estable de una manganeso peroxidasa (gen MnP-2) en el genoma de cloroplastos de tabaco. Se construyeron seis vectores: pES4, pES5, pES6, pHM4, pHM5 y pHM6 derivados de pPRV111A conteniendo los genes sintéticos PelA, MnP- 2, Bgl1, CelA-CelB, CelA y CelB, respectivamente. Los genes se flanquearon por un promotor sintético del gen rrn16S y una secuencia sintética 3’UTR del gen rbcL. La integración en la región intergénica rrn16S y 3'rps12 se confirmó por análisis de Southern blot. El procesamiento estable de los transcritos se confirmó por un análisis de Northern blot. Se realizó un análisis enzimático para detectar la expresión y funcionalidad de las enzimas recombinantes, las plantas maduras mostraron mayor actividad comparado con plantas de tipo silvestre. Las plantas transplastómicas exhibieron 58.5% más actividad de pectinasa a pH neutro y a 60°C, mientras que manganeso peroxidasa mostró alta actividad a pH 6 y 65°C; en el caso de las celulasas, todas las enzimas mostraron mayor actividad a pH 5 (β-glucosidasa: 30.45 xviii U/mg, CelA-CelB 58 U/mg, CelA 49.10 U/mg y CelB 48.72 U/mg) a 40°C para β- glucosidasa y 65°C para celulasas. Las plantas transplastómicas mostraron un desarrollo similar a las plantas de tipo silvestre; sin embargo, la línea pHM4 mostró fenotipos variegados en hojas. Los análisis mostraron que los genes de enzimas hidrolíticas PelA, MnP-2, Bgl1, CelA-CelB, CelA y CelB pueden integrarse y expresarse en el genoma de cloroplastos con alta actividad; de este modo, debido a que una planta madura en promedio cuenta con ~ 470 g de biomasa, es posible producir 66,676.25 unidades de pectinasa, 21,715.46 unidades de manganeso peroxidasa, 338,081.0 unidades de celulasas A-B, 231,456.7 unidades de celulasa A, 206,669.8 unidades de celulasa B y 139,395.0 unidades de β-glucosidasa por planta. Este estudio sustenta información sobre métodos y estrategias de expresión de enzimas hidrolíticas con potencial aplicación biotecnológica utilizando plantas transplastómicas.

Niveles de expresión de citocromos P450 (CYP6AA7, CYP4C52v1, CYP6BY3, CYP9J34, CYP9M10, CYP9J40 y CYP9AL1) determinados por RT-qPCR en larvas de Culex quinquefasciatus expuestas a diversos insecticidas.

En el presente trabajo, se describen los niveles de expresión de siete transcritos de Culex quinquefasciatus que codifican para citocromos P450, estos medidos por qPCR en larvas expuestas a dos concentraciones del insecticida permetrina (0.51 y 0.71 mg) comparadas con un grupo control sin exponer, las cuales fueron colectadas en distintas localidades del noreste de México. Debido a que los genes analizados no se encontraban reportados, fue necesario diseñar oligonucleótidos utilizando secuencias trazas producto de la secuenciación del genoma del mosquito antes mencionado. Con los oligonucleótidos diseñados y utilizando DNA complementario, sintetizado a partir de RNA total de las larvas fueron amplificados por PCR los mensajeros, se procedió a clonar cada uno de estos genes en nueve poblaciones analizadas, posteriormente fueron secuenciados y éstas fueron comparadas para deducir los porcentajes de similitud. Se diseñaron sondas taqman en segmentos conservados, y utilizando el DNA complementario previamente sintetizado fueron deducidos los niveles de expresión de cada uno de los genes analizados bajo las condiciones citadas anteriormente para las poblaciones. Con el trabajo realizado, reportamos las secuencias nucleótidicos y aminoacídicas de cada uno de los genes analizados de cada una de las poblaciones estudiadas y sus niveles de expresión. Concluimos que los genes analizados son una herramienta potente para ahondar en el estatus de resistencia que han desarrollado las poblaciones silvestres de Culex quinquefasciatus en localidades del noreste de México.

Expresión genética en escherichia coli controlada por medio de temperatura y potencialmente con luz para el diseño de agentes terapéuticos

Utilizando la interfase entre la biología sintética y la nanotecnología, se propone el diseño de un material (bacteria), con sensibilidad optotérmica; es decir, que la sinergia entre la capacidad de las nanopartículas metálicas para convertir la luz absorbida en calor y la propiedad de respuesta térmica del termómetro de RNA, permitan una respuesta a la exposición de longitudes de onda concretas a nivel local, y además puedan ser controlados con el uso de incrementos globales en la temperatura del sistema, permitiendo con ello un precursor viable para el diseño posterior de nuevos agentes terapéuticos que actúen de forma específica y controlada. La metodología para construir los plásmidos incluyó métodos clásicos para su clonación (digestión, ligación y transformación), para la biosíntesis de AgNPs se trabajó con diferentes concentraciones de AgNO3, y cuatro cepas de Escherichia coli en fase log. Se comprobó la viabilidad de las cepas por medio de la técnica de la gota en superficie, así como la actividad del termosensor y expresión de la proteína mcherry.Contribuciones y Conclusiones: Se realizaron satisfactoriamente las transformaciones de Escherichia coli k

Expresión, purificación y caracterización de proteínas quiméricas de RsbP con el dominio sensorial Per‐ARNT‐Sim y dominios de respuesta histidina quinasa y fosfatasa

Los organismos monitorean una serie de señales internas y externas para ajustar su comportamiento frente a diferentes entornos. Las proteínas encargadas de la transducción de señales son llamadas proteínas sensoriales, y éstas contienen dominios sensoriales que son sensibles a las señales tales como la absorción de la luz o la unión de una sustancia química o ligando; y dominios de respuesta que poseen actividad biológica. Algunas proteínas sensoriales contienen dominios Per-­‐ARNT-­‐Sim(PAS), estos dominios son relativamente pequeños, de aproximadamente 110 aminoácidos y han sido reportados en todos los reinos de la vida. En proteínas, un dominio se caracteriza por una secuencia de aminoácidos específica, sin embargo, los dominios PAS difieren de esta definición, pero sí se caracterizan por poseer una estructura definida que consta de cinco plegamientos beta antiparalelos flanqueados por varias alfa hélices cuya estructura les permite detectar cambios físicos y químicos. Estos dominios pueden activar diferentes dominios de respuesta, que en bacterias incluyen a fosfatasa e histidina quinasa. Se planteó la siguiente hipótesis: El dominio Per-­‐ARNT-­‐Sim(PAS) de RsbP es capaz de interactuar con distintos dominios derespuesta, ya sea fosfatasa o histidina quinasa formando estructuras cuaternarias definidas. El objetivo general es: Establecer la relación estructura-­‐función de dominios PAS bacterianos determinando interacciones específicas con distintos dominios de respuesta. La metodología incluye las técnicas de clonación tradicionales, expresión y purificación de proteínas por medio de cromatografía por afinidad y por intercambio aniónico y finalmente el estudio del estado oligomérico por medio de cromatografía de exclusión. Contribuciones y Conclusiones: en el presente estudio se expresó, purificó y caracterizó el dominio sensorial PAS de RsbP (RsbP-­‐PAS) y la proteína completa RsbP de B. subtilis. Estas proteínas seexpresaron y purificaron utilizando la proteína glutatión S-­‐transferasa (GST) como proteína de fusión. Mediante cromatografía de exclusión por tamaño se determinó la estructura cuaternaria del dominio sensorial PAS de RsbP siendo un monómero y la proteína completa RsbP como tetrámero. Además en este estudio se llevó a cabo la construcción de dos proteínas quiméricas de RsbP. La primera esta compuesta de la siguiente manera, (RsbP-­‐PAS) como domino sensorial, bucle enrollado, el cual conecta al domino sensorial con el dominio de respuesta, e histidina quinasa (PAS-­‐HPK) como dominio de respuesta; y la segunda, (RsbP-­‐PAS) como domino sensorial, el primer dominio PAS del fitocromo A que conecta ambos dominios y fosfatasa como dominio de respuesta (PAS-­‐PASalt-­‐PPM). Estas proteínas se expresaron utilizando la proteína glutatión S-­‐transferasa como proteína de fusión la cual permite la purificación por afinidad. En el caso de PAS-­‐HPK se obtuvo suficiente proteína soluble, sin embargo,PAS-­‐PASalt-­‐HPK mostró la presencia de cuerpos de inclusión los cuales disminuyen el rendimiento de proteína soluble y dificultansu purificación. Es importante señalar que en estudios posteriores se mejorará la obtención de proteína soluble de las proteínas quiméricas, para mejorar sus rendimientos de purificación y su caracterización y de esta manera conocer el estado oligomérico que éstas presentan; para corroborar la teoría que el dominio PAS puede activar diferentes dominios de respuesta ya sea con la presencia del bucle enrollado y/o la presencia de dominios PAS alternos; y posteriormente determinar los mecanismos de transducción de señales que estos dominios presentan.

Palabra e imagen en el arte chicano: breve ensayo sobre la categoría del riesgo en su expresión artística visual

El presente ensayo trata de presentar una visión personal del proceso de aceptación del arte chicano no sólo en los Estados Unidos, sino también entre los mexicanos que viven en México y el resto del mundo. Sobre la palabra y el sujeto chicano aún orbita toda una estela de conceptos. Usualmente vistos como delincuentes, pandilleros o figuras desarraigadas, no pertenecientes al espacio norteamericano en que habitan, una ojeada a su historia revela una condición impuesta de foráneo, de residente no acreditado, que dista mucho de constituir su realidad.

Expresión génica diferencial y antioxidantes en la planta de tomate (Solanum lycopersicon L. Mill) enriquecida con selenio

La biofortificación tiene como finalidad incrementar la concentración de elementos biodisponibles en las plantas de cultivo para elevar la calidad nutricional. El selenio es un elemento traza de gran impacto para el metabolismo antioxidante de las plantas y su acumulación es pobre en especies como el tomate, de igual manera este elemento es esencial para los humanos, por lo que adicionarlo en las plantas forma parte de los programas de biofortificación. El propósito de este trabajo fue analizar experimentalmente la capacidad del selenito de sodio para incrementar la concentración de Se y modificar la actividad antioxidante en plantas de tomate. Para ello se usaron plantas de la variedad híbrido Toro y se aplicaron tres tratamientos 0, 2 y 5 mg L-1 de selenito de sodio (Na2SeO3) utilizando como vehículo el agua de riego, los tratamientos fueron aplicados bajo un diseño experimental completamente al azar. Se llevaron a cabo tres muestreos 40, 80 y 120 días después del trasplante y la subsecuente cuantificación de la acumulación de selenio y macronutrientes en hojas, tallos y frutos así como su impacto en la producción de frutos bajo un diseño experimental completamente al azar. Se determinó la altura de la planta, los diámetros de tallos, firmeza, sólidos solubles de frutos y la materia seca total de los diferentes tejidos. Se obtuvo una cuantificación del potencial oxido reducción y de la actividad de antioxidante específicos como la catalasa, glutatión peroxidasa, superóxido dismutasa, el ácido ascórbico y licopeno, para cada variable se llevó a cabo un análisis de varianza y posteriormente una prueba de comparación de medias de Tukey. La expresión de los genes cat, gpx, sod, apx y lic en los frutos fue también analizada y en este caso se aplicó un análisis de varianza no paramétrico de Fisher, para encontrar las diferencias entre tratamientos. Los resultados mostraron un incremento en la acumulación de Se, encontrándose hasta un 53.1% de aumento en la concentración en los frutos bajo el tratamiento 5 mg L-1 en comparación con el testigo, sin embargo, este incremento no tuvo un impacto notorio en la producción y el rendimiento del tomate, a pesar de la existencia de una correlación de Spearman positiva (r =0.9637) entre la producción de fruto y la concentración de Se. Los valores del potencial oxido-reducción se redujeron en promedio desde -41.4 mV para el tratamiento testigo y hasta -68.0 mV con el mayor tratamiento. Mientras tanto, la concentración de Se si influyó positivamente en los parámetros de calidad incluyendo el ácido ascórbico (hasta un 50 % de aumento con el tratamiento 5 mgL-1 ) y el licopeno (hasta un 66.9% de aumento con el mayor tratamiento). La actividad de las enzimas antioxidantes aumentó notablemente en el fruto con el tratamiento 5 mg L-1 de selenito encontrándose 60.9% de aumento para CAT, 33.4% para GPX y 26.0% para SOD. En cuanto la expresión génica hubo mayor nivel de transcriptos de los genes gpx, sod y apx bajo el tratamiento 2 mg L-1

La expresión artística como herramienta para el manejo emocional en pacientes con cáncer y factores psicosociales asociados

Resumen: La expresión artística como herramienta para el manejo emocional en pacientes con cáncer y aspectos psicosociales asociados. El objetivo de este trabajo fue explorar los aspectos psicosociales asociados en 15 pacientes que padecen cáncer, derechohabientes a los servicios de salud de una universidad, en términos de las emociones, el apoyo social, afrontamiento y la conceptualización/atribución de la enfermedad. Conocer cuáles son los pensamientos y emociones que sobresalen en las personas que enferman de cáncer e indagar cuáles son las formas en que las manifiestan, así como también el cómo las manejan o replantean. Se implementa también una técnica de intervención psicológica con dichos pacientes basada en el uso de la expresión artística, que permite a los pacientes experimentar un ambiente de intervención psicológica el cual se construye a través de cómo las personas utilizan cualquier expresión artística y por medio de ella trabajar sus vivencias en relación al proceso de la enfermedad. Se presentan resultados del impacto de esta técnica en 9 pacientes con cáncer, los cuales muestran que ésta es de beneficio para ellos, al igual que para aquellos profesionales que participan en el diseño de programas de evaluación/intervención para este tipo de pacientes. El trabajo de explorar estas temáticas desde un abordaje psicológico, más allá de los aspectos médicos, surge del conocimiento y la experiencia de encontrar en las diversas instituciones de salud de nuestro entorno poca atención a los factores psicológicos delos pacientes como son su emociones, sus creencias, sus expectativas y el impacto de su enfermedad en su entorno familiar y social. Este déficit de trabajo en los aspectos psicológicos de los pacientes con cáncer se encuentra tanto en las instituciones como en los profesionales de la salud, así como también por parte de los mismos pacientes.Todo esto presupone una serie de repercusiones o sucesos que están relacionados con los procesos de vivencia de la enfermedad de cáncer.

Análisis de la expresión de miRNAs en trofozoítos de entamoeba histolytica.

Entamoeba histolytica representa una de las principales causas a nivel mundial de muertes por parasitosis. Aunque se ha identificado como el agente causal de la amibiasis desde 1875, los mecanismos moleculares por los cuales este parásito causa la enfermedad aún no estan completamente comprendidos. Los microRNAs (miRNAs) son grupos de RNAs pequeños no codificantes que juegan un papel importante en la regulación de la expresión de genes y la traducción de proteínas en una gran variedad de organismos. Su identificación ha sido un paso importante para facilitar y entender la biología, organización y evolución del genoma, así como su regulación posttranscripcional, sin embargo en E. histolytica no se tiene registro de la presencia de estas moléculas reguladoras. En nuestro laboratorio a partir de un cultivo de trofozoitos de E. histolytica en condiciones axénicas se aislaron los RNA totales y se purificaron en una fracción de 15 a 50 nucleótidos los cuales se utilizaron para construir una biblioteca de RNAs pequeños que posteriormente fueron secuenciados y en donde se detectaron 199 miRNAs exclusivos para este parásito. Durante el desarrollo de esta tesis, se analizó la expresión de miRNAs en trofozoítos de E. histolytica HM1-IMSS, usando la técnica de microarreglo µParaflo Microfluidic Biochip Technology y posteriormente se realizó la verificación de la expresión de los miRNAs mediante RT-PCR Tiempo Real. Los resultados del microarreglo demostraron la expresión 41 candidatos a miRNAs de los cuales se confirmó la presencia de 9 microRNAs de E. histolytica (Ehi-miRNAs) mediante RT-PCR Tiempo Real. La estructura de los Ehi-miRNAs permitió predecir 32 probables genes blanco ya descritos y 34 genes hipotéticos probables. Los resultados obtenidos postulan una colección de miRNAs reguladores en E. histolytica que generan una plataforma para analizar molecularmente la estructura genómica, regulación génica y validación de los Ehi-miRNAs en este parásito

Expresión de FOXP3 en células de melanoma murino como un mecanismo de evasión de la respuesta inmune tumoral

Foxp3 es un marcador clave para identificación y función células T reguladoras, además su expresión se ha observado en diferentes líneas celulares de cáncer. El objetivo de este estudio fue determinar si la expresión de Foxp3 en células de melanoma murino actúa como un mecanismo de evasión de la respuesta inmune tumoral, modificando citocinas involucradas en la fase de inmunoedición de cáncer y promoviendo la generación de células Treg. En este estudio se determinó por primera vez la expresión de Foxp3 en las células melanoma murino B16F10 wt, y diseñamos RNA de interferencia en contra de Foxp3, además de analizar la expresión de CD25 y producción de IL-2, INF-γ, TGF-β e IL-10 para determinar su papel in vitro. Para la evaluación del efecto de Foxp3 durante el desarrollo tumoral in vivo, se estableció una línea celular con silenciamiento de Foxp3 la cuál identificamos como B16F10.DMH1 y se montaron dos modelos de melanoma murino, uno inducido con células B16F10 wt y otro inducido con células B16F10.DMH1, y se analizó progresión tumoral, producción de citocinas, expresión de CD25, Foxp3 y poblaciones celulares CD4+ , CD4+CD25+ y CD4+CD25+ Foxp3+ en TIL’s y células de bazo. Nuestros resultados in vitro demuestran que las células B16F10 wt expresan Foxp3 a nivel de RNAm y proteína, y su localización celular es principalmente perinuclear, además se encontró que estas células expresan CD25, y una producción de citocinas del tipo INF-γ, TGF-β, IL-10 e IL-2. Se encontró que la expresión de Foxp3 afecta la proliferación en células B16F10, encontrando una correlación positiva entre la expresión de Foxp3, CD25 e IL-2. In vivo, el silenciamiento de Foxp3 en las células B16F10.DMH1 afectó el desarrollo del melanoma incrementando el tiempo de aparición de tumor, sobrevida y disminuyendo el peso de los tumores, encontrando una correlación positiva entre Foxp3, CD25, IL-2 e IL-10 y negativa con la producción de IFN-γ, además se determinó que Foxp3 intratumoral está correlacionado con la expresión y presencia de células Treg con fenotipo CD4+CD25+ Foxp3+ en el microambiente tumoral y con una disminución de células T CD4+ a nivel periférico, sin afectar a linfocitos T activados (CD4+CD25+ ). Estos datos sugieren que Foxp3, participa en el desarrollo de la tumorogénesis en melanoma murino in vitro e in vivo, con la capacidad de modular a citocinas, moléculas involucradas en el desarrollo tumoral, así como poblaciones celulares con fenotipo regulador en el tumor, pero no en periferia.

Construcción y evaluación de un promotor eucariótico que controla la expresión de genes heterólogos en condiciones de hipoxia

La hipoxia es una característica común en los tumores sólidos, contribuyendo local y sistémicamente a la progresión tumoral, además de la falta de respuesta a la radioterapia y quimioterapia. La presencia de regiones hipóxicas en neoplasias malignas es uno de los factores predictivos más importantes, debido a que induce una amplia gama de respuestas fisiológicas y desempeña un papel crucial en la patogénesis de varias enfermedades humanas. Paradójicamente la hipoxia también es un blanco terapéutico atractivo ya que se produce hipoxia severa solo en el tejido del tumor sólido. El sistema de regulación HRE/HIF1 es común en todas las células de mamíferos y tejidos humanos, se puede utilizar para lograr la expresión selectiva de genes terapéuticos en condiciones de hipoxia. Cuando HREs derivados de diferentes genes se colocan en plásmidos y sistemas de vectores virales, confieren inducibilidad hipóxica sobre los promotores heterólogos en varios tipos de células por lo que la hipoxia puede ser explotada para el tratamiento de cáncer selectivo. En el presente trabajo se creó y caracterizó el vector hipóxico pHRE-Luc y se comprobó su funcionalidad en la línea celular B16F10 mediante la medición de la expresión génica del gen reportero luciferasa en condiciones de hipoxia y normoxia bajo la influencia de 6 copias de elementos sensible a la hipoxia (HRE) del gen de la eritropoyetina (Epo). Los resultados muestran que en condiciones de hipoxia, el vector pHRE-Luc (6HRE-Luc) fue 4 veces más eficiente que en normoxia para inducir la expresión génica. Este vehículo proporciona las bases para plantear un sistema sitio dirigido a las regiones hipóxicas de los tumores para terapia génica específica del cáncer.