Evaluación de los perfiles de respuesta a interferón inducidos como respuesta a la infección con el virus del dengue

Introducción: El dengue es la principal enfermedad viral transmitida a humanos por artrópodos. Una de las características del cuadro clínico de la infección por el virus del dengue (DENV) es su alta variabilidad en la severidad, pronóstico y resolución de la enfermedad. Estudios recientes sugieren que diferentes cepas virales parecen inducir respuestas de interferón variables y que de ello pudiese depender la presentación clínica. No existen estudios previos que evalúen este fenómeno en cepas virales circulantes en México. Sumado a esto, se ha reportado que 80% de las infecciónes por DENV son asintomáticas: por lo tanto, los donadores de sangre virémicos son un riesgo para la seguridad en transfusiones. También nos propusimos estudiar si la seroprevalencia de anticuerpos anti-DENV permanecía constante en donadores de sangre con respecto al tiempo. Objetivo: Conocer la contribución epidemiológica e impacto del dengue en Nuevo León, así como establecer si existe una asociación entre la patogénesis y la variabilidad genética de los serotipos 1 y 2 del DENV, mediante la evaluación de los perfiles de expresión y respuesta a interferón, en cultivos celulares infectados con cepas virales aisladas a partir de sujetos mexicanos virémicos. Materiales y métodos: Se hizo un estudio retrospectivo de los registros semanales de CENAVECE para conocer el panorama actual oficial del dengue en Nuevo León. En colaboración con el banco de sangre HU y el Centro Estatal de la Transfusión se recolectaron 285000 donaciones de sangre en el periodo de enero 2010 a diciembre 2012, con carta de consentimiento informado. A 2061 donadores sanos se les realizó ELISA para buscar anticuerpos contra Brucella, VHC, VDRL, HBsAg, HIV1 y 2, WNV, DENV IgM-IgG. Los sueros positivos a DENV se confirmaron por detección de NS1-DENV y RT-qPCR. A la par en colaboración con LESP-NL se recolectaron 1079 sueros NS1-DENV positivos de Nuevo León los cuales se analizaron por PCR en tiempo real para identificar serotipos, y fueron sembrados en células C6/36 para aislar partículas virales. Los virus aislados se titularon en células BHK-21. Posteriormente, se infectaron células Huh-7 a una m.o.i. de 0.1 durante 36h. Se usaron como control virus prototipo inactivados con luz UV. Transcurrido el tiempo de infección, las células se trataron 1h con IFNα (1000UI/mL). Los RNAs totales se montaron sobre arreglos de PCR tiempo real (PAHS-016Z, QIAGEN) para evaluar la respuesta de interferón de las cepas aisladas de pacientes. Resultados: Se encontró que en el transcurso de 5 años, el estado de Nuevo León pasó del lugar 12 al 5º con mayor incidencia de dengue a nivel nacional, y que la seroprevalencia de anticuerpos anti-DENV en donadores asintomáticos fue del 2.6%. Se aislaron 13 virus a partir de cutivos celulares infectados con sueros NS1 positivos y los virus tuvieron la capacidad de infectar otras líneas celulares, generar partículas infecciosas funcionales y de generar enfermedad en un sistema In vivo. Al infectar células Huh-7 se observó que las cepar virales tenían una capacidad diferente para modular la respuesta de interferón, regulando con diferente intensidad diferentes genes involucrados en el establecimiento del estado antiviral intracelular. Los virus serotipo 2 indujeron niveles de expresión más altos que los virus serotipo 1.

Evaluación del efecto de la intoxicación aguda por Karwinskia humboldtiana en el páncreas de la rata Wistar

Propósito y método del estudio: Cuando se ingieren grandes cantidades de fruto de Karwinskia humboldtiana se produce una intoxicación aguda, que ocasiona daño en múltiples órganos, falla respiratoria y muerte en pocos días. En la intoxicación accidental y experimental con este fruto, se ha reportado daño histológico en pulmones, hígado y riñones. Se sabe que el daño histológico a estos órganos, además de la falla multiorgánica, son situaciones comunes cuando existe daño pancreático, sin embargo, hasta la fecha, el páncreas no ha sido estudiado en esta intoxicación. En este trabajo examinamos el efecto que ocasiona la intoxicación aguda con el fruto de Karwinskia humboldtiana en el páncreas en la rata Wistar. Contribuciones y conclusiones: En este trabajo se encontró daño progresivo confinado a la porción exocrina del páncreas, iniciando con reducción en el tamaño de los acinos pancreáticos, así como del número de gránulos de zimógeno, presencia de vesículas de apariencia autofágica y apoptosis, seguidos de edema, infiltrado inflamatorio, necrosis y pérdida completa de la arquitectura acinar. Cabe señalar que la morfología de los islotes de Langerhans se mantuvo conservada en todos los tiempos evaluados en este trabajo. Mediante las técnicas Western Blot e inmunofluorescencia, analizamos la expresión y localización de proteínas implicadas en la autofagia (LC3-I y LC3-II) y en la apoptosis (caspasa-3). Observamos que las proteínas LC3-I y LC3-II se encuentran expresadas en todos los tiempos experimentales, mientras que la proteína caspasa-3 se expresó únicamente a las 48 h de la intoxicación con Karwinskia humboldtiana. Mediante ensayos de histoquímica enzimática para la citocromo oxidasa c, comprobamos que desde las 24 h de intoxicación, existen cambios en la forma, tamaño y localización de las mitocondrias, organelos implicados en la muerte celular. Asimismo, realizamos la evaluación de la función pancreática mediante la determinación de la actividad de la amilasa sérica, sin encontrar diferencia significativa entre los grupos estudiados. Todos estos datos indican que el daño inducido por una dosis alta de fruto de Karwinskia humboldtiana en la rata Wistar, es consistente con una pancreatitis aguda necrotizante que afecta exclusivamente el páncreas exocrino. Este modelo de pancreatitis puede ser útil para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares implicados en este padecimiento, así como para el ensayo de posibles tratamientos para esta y otras enfermedades pancreáticas.

Producción y caracterización de la superóxido dismutasa a (SodA) de nocardia brasiliensis en pichia pastoris

Introducción: A mediados de los años 70’s del siglo pasado el descubrimiento de la tecnología del ADN recombinante marca el inicio de la era de la biotecnología moderna. La implementación de estas tecnologías permitió la utilización de organismos como sistemas de expresión que a lo largo de los años ha generado la producción de una gran variedad de productos biológicos. Dentro de estos sistemas Pichia pastoris es un sistema de expresión ampliamente utilizado debido a sus características tales como la producción de proteínas en grandes cantidades, la liberación de los productos al medio de cultivo, la obtención de productos complejos que requieren modificaciones postraduccionales típicas de los eucariotas o que contienen puentes disulfuro, entre otras. Nocardia brasiliensis es una bacteria parcialmente ácido-alcohol resistente la cual forma colonias granulares, con hifas aéreas escasas, sus colonias exhiben un color anaranjado pardo con bordes en blanco. N. brasiliensis es patógena para el ser humano y es el agente causal del actinomicetoma. El actinomicetoma es una enfermedad crónica generalmente localizada en las extremidades. Se caracteriza por ser un proceso lento de tumefacción con nódulos, abscesos y fístulas.La Superóxido Dismutasa (SOD) es una enzima reductora polimérica que cataliza la conversión del ión superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular. La SOD ha sido propuesta como un factor de virulencia de microorganismos patógenos, cuya acción consiste en bloquear los efectores oxidativos del estallido respiratorio iniciado por los fagocítos en el fagolisosoma. Este mecanismo ha sido descrito para bacterias de los géneros Mycobacterium, Rhodococcus y Nocardia. Objetivo: producir y caracterizar la Superóxido Dismutasa A (SODA) de Nocardia brasiliensis en Pichia pastoris. Metodología: se realizó el diseño de primers adicionando secuencias de sitios de corte para las enzimas XhoI y AvrII, así como una cola de histidinas en el extremo 5’ para la amplificación del gen sodA de N. brasiliensis a partir del ADN genómico de Nocardia brasiliensis. El amplicón se clonó en el vector de expresión pPIC9. Se llevó a cabo la transformación por electroporación de levaduras Pichia pastoris GS115. La producción de SOD se llevó a cabo en inducciones de 96 h con metanol como agente inductor. Los sobrenadantes se dializaron con membranas de celulosa. Los dializados se observaron por SDS-PAGE y western blot. Se analizó la actividad funcional de la enzima con el SOD Assay kit de Sigma Aldrich. Resultados: Por reacción en cadena de la polimerasa se obtuvo una secuencia de 625 pb correspondiente al gen sodA. El fragmento se ligó al vector de expresión pPIC9 y fue caracterizado con las enzimas de restricción XhoI y AvrII. Las cepas trasformadas de P. pastoris GS115 se caracterizaron con el gen aox1 obteniendo cepas Mut+ y Muts. Los análisis por SDSPAGE mostraron bandas no observadas en el control negativo de expresión mientras en los western blot solo una de las clonas mostró señal. Los análisis de actividad funcional sugieren inhibición de la reacción enzimática infiriendo presencia de la proteína SOD en el medio dializado. Conclusiones: Se logró la construcción del sistema de expresión Pichia pastoris con el casete de expresión de la SOD de N. brasiliensis. Así como la generación de cepas Mut+y Muts. En los ensayos de actividad funcional se observó inhibición de la reacción enzimática.

Evaluación de la integridad ecológica en la comunidad de matorral submontano de la sierra de Picachos, Nuevo León, México

La Sierra de Picachos representa una isla biogeográfica y funciona como una estación o paradero para la fauna migrante de norte a sur y viceversa. Está considerada de acuerdo como una Región Prioritaria para la Conservación, además de un Área de Importancia para la Conservación de las Aves y un área natural protegida para el estado de Nuevo León. Esta Sierra presenta varios tipos de ecosistemas como el Matorral Xerófilo en su variante de Matorral Submontano, el Bosque deciduo, en su variante de Quercus spp. y Bosque de Coníferas, en su variante de Bosque de Pinus spp. La comunidad de matorral Xerófilo es de gran importancia debido a que alberga a las especies tipo que caracterizan a las comunidades de Matorral Submontano en la región noreste de México. Además, la Sierra es considerada una región con bajo riesgo y poco amenazada, ya que grandes porciones de la sierra son de propiedad privada por lo que existen áreas relativamente conservadas. En el presente estudio se utilizó un índice multimétrico para evaluar la Integridad Ecológica del Matorral Submontano de la Sierra de Picachos, Nuevo León, mediante el cual fue posible conocer la condición en que se encuentra este sitio y será útil para tomar futuras decisiones de conservación. Esta evaluación se realizó mediante la determinación de cuatro Índices de Calidad Ambiental: 1) Índice de Densidad de la Vegetación, 2) Índice del Valor Ecológico, 3) Índice de Valoración del Paisaje 4) Índice de la Condición del Desarrollo Vegetal y finalmente el Índice de Integridad Ecológica es resultado de la sumatoria de cada uno de los cuatro índices evaluados. Fue posible también calcular la riqueza y diversidad de la plantas y de la ornitofauna del matorral submontano. El resultado obtenido por el Índice de Integridad Ecológica para el matorral submontano de la Sierra de Picachos fue de 3.311 por lo que su condición o integridad es “Alta”. Sin embargo el matorral submontano se encuentra bajo una fuerte presión de constante extracción como leña, el agostadero, extracción de aves canoras y actividades de pesca y caza furtiva. La comunidad de matorral submontano presenta 214 especies de flora y 195 especies de aves. La evaluación de un método que de manera integral incluye la estimación de diversas variables, resulta mejor para la determinación de la condición de un ecosistema en comparación con aquellas que son evaluadas de manera unidimensional. Las herramientas de evaluación de los impactos ambientales son compatibles con la metodología propuesta para el uso de índices multimétricos como es el Índice de Integridad Ecológica propuesto en este estudio.

Efecto del tipo de explante, regulador de crecimiento y medio de cultivo sobre la capacidad morfogénica de jatropha curcas L.

La especie Jatropha curcas L., comúnmente conocida en México como piñoncillo, es una planta productora de aceite que ha recibido gran atención en recientes años al utilizarse como fuente de energía por su gran potencial para la elaboración de biodiesel. Sin embargo, su introducción mundial como especie bioenergética se ha dado con diferentes grados de éxito debido al heterogéneo rendimiento de semillas y contenido de aceite como consecuencia de su amplia variabilidad genética. Esto ha impulsado la selección de genotipos elite, los cuales deben contar con un protocolo de propagación clonal por medio del cultivo de tejidos vegetales para acelerar el desarrollo de cultivares. La mayoría de los estudios morfogénicos se han hecho a partir de explantes de genotipos procedentes de la India, de modo que es necesario el estudio de los factores que afectan la morfogénesis en genotipos mexicanos, debido a la amplia variación genética. Los objetivos del presente estudio fueron: i) evaluar la expresión morfogénica de explantes bajo diferentes niveles de reguladores de crecimiento (thidiazurón, 6- bencilaminopurina y ácido indol-3-butírico) en dos medios de cultivo (Yasuda y MS), ii) estudiar la respuesta de explantes por efecto de 500 mg L-1 de polivinilpirrolidona (PVP) en la etapa de establecimiento in vitro de dos genotipos de Jatropha curcas (INI-3 e INI-6), y iii) determinar el comportamiento de la enzima polifenol oxidasa (PPO) en explantes de hoja y peciolo de dos genotipos de Jatropha curcas (INI-3 e INI-6) bajo la aplicación de hipoclorito de sodio (NaClO) al 3.24 % como agente desinfectante. En la etapa de establecimiento in vitro se evaluó el efecto del PVP en explantes de hoja y peciolo de los genotipos INI-3 e INI-6 bajo un diseño completamente al azar (DCA) con un arreglo factorial 2x2 con 90 repeticiones por tratamiento y un explante por unidad experimental, donde en el factor A fueron los genotipos (INI-3 e INI-6) y el factor B las dosis de PVP (control y 500 mg L-1). Las variables evaluadas en una prueba de ji-cuadrada fueron: viabilidad y presencia de callo, mientras que el peso de callo se evaluó por un análisis de varianza. En la etapa de inducción se analizaron los medios de cultivo Yasuda y MS más la interacción con diferentes dosis de thidiazurón (1.5 y 3.0 mg L−1), 6-bencilaminopurina (1.5 y 3.0 mg L−1), y (AIB) ácido indol-3-butírico (0.0, 0.5 y 1.0 mg L−1) en explantes de peciolo del genotipo INI-6, bajo un DCA con arreglo factorial 2x2x2x3 con tres repeticiones, compuestas de dos explantes por unidad experimental, donde la variable presencia de callo fue evaluada en un análisis de regresión logística. La determinación de la actividad de PPO se realizó bajo un DCA con arreglo factorial 2X2X2 con tres repeticiones, donde en el factor A fueron las dosis de NaClO (control y 3.24 %), el factor B los tipos de explantes (hoja y peciolo) y el factor C los genotipos (INI-6 e INI-3). Los resultados del establecimiento in vitro mostraron que únicamente el explante de peciolo fue viable al cultivo, revelando que los genotipos de estudio no presentan asociación con las frecuencias de explantes viables de acuerdo con las pruebas de ji-cuadrada. En esta misma etapa se encontró que la viabilidad de explantes varió según la posición del peciolo con base en el ápice terminal, donde los explantes del segundo nudo presentaron la mayor viabilidad con base en una prueba de jicuadrada. Además, la adición de PVP aumentó la viabilidad de explantes de peciolo e indujo la proliferación de callo con una diferencia significativa en la producción de callo fresco entre genotipos según el análisis de varianza. En la etapa de inducción se encontró que los factores AIB y TDZ además de las interacciones “TDZ*AIB” y “TDZ*BAP*AIB” están relacionadas significativamente con la presencia de callo y ningún tratamiento indujo el desarrollo de brotes a las ocho semana de cultivo in vitro. En la determinación de la actividad de PPO, se encontró que estadísticamente la aplicación de NaClO al 3.24 % causa el aumento en la actividad de PPO, además se descubrió diferencias estadísticas entre explantes y genotipos de estudio.

Evaluación antimicrobiana de rifampicina nanoencapsulada contra aggregatibacter actinomycetemcomitans presente en la periodontitis

Introducción. A pesar de los esfuerzos tanto de la medicina como de la industria farmacéutica, el incremento en la prevalencia de resistencia en bacterias patógenas frente a antibióticos se ha vuelto uno de los mayores problemas en la medicina moderna. El área odontológica tampoco se encuentra exenta, siendo común el uso excesivo de antibióticos lo que contribuye al desarrollo de resistencia antimicrobiana. La primera etapa para el desarrollo de la enfermedad periodontal es la formación de un biofilm de bacterias periodontopatógenas, siendo el Aggregaribacter actinomycetemcomitans (A.a) uno de los más asociados a dicha enfermedad. El tratamiento de esta patología se basa en remover mecánicamente la placa dentobacteriana y, en segunda instancia, en el apoyo de terapia antimicrobiana para coadyuvar la eliminación de las bacterias periodontopatógenas, cuales tienen gran similitud con Mycobacterium tuberculosis. La rifampicina es uno de los antibióticos efectivos contra bacterias multi-resistentes y la primera elección en el tratamiento de tuberculosis activa. Con el fin de mejorar la terapia farmacológica y evadir la resistencia del agente infectivo, se han propuesto nuevas estrategias basadas en sistemas de liberación controlada. Entre los más estudiados en los últimos 10 años se encuentran las nanopartículas poliméricas. El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad antimicrobiana de la rifampicina nanoencapsulada contra el A.a presente en la periodontitis. Materiales y Métodos. Para el estudio, Se tomaron muestras de fluido crevicular en pacientes con bolsas periodontales de 5-10 mm de profundidad. Se inoculo caldo de tripticaseina de soya (TCS) con las muestras tomadas y se incubaron a 37 ° C en condiciones aeróbicas por 7 días. La presencia de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a) fue determinado mediante PCR en tiempo real. La Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) de rifampicina para interferir con el crecimiento de bacterias orales fue determinada mediante la técnica de dilución de tubos. Posteriormente se prepararon mediante la técnica de nanoprecipitación NP de Eudragit® EPO, L100-55 y PLA entre 100 y 200 nm y su IP con distribución de tamaño homogéneo. Resultados. A.a fue detectado en muestras de fluido crevicular en pacientes con periodontitis, corroborando su asociación con dicha patología. La efectividad de la rifampicina libre contra bacterias orales fue confirmada, obteniéndose una CMI de 1 µg/ml. Las NP con Rifampicina se ajustaron a la misma CMI que la Rif libre. Las NP de Eudragit® EPO cargadas con Rif mostraron que la liberación de la Rif de la NP fue inmediata, mientras que el Eudragit® L100-55 y PLA con Rif no mostró inhibición durante los 5 días de incubación. Esto hace suponer que el fármaco no fue liberado o solo se liberó en una baja proporción que no permitió llegar a la CMI. Conclusión. La rifampicina es una excelente alternativa terapéutica para el tratamiento de la enfermedad periodontal, promoviendo resultados favorables en la evaluación clínica de pacientes. Sería interesante continuar con estudios utilizando otro polímero o mezcla de ellos para favorecer la liberación del fármaco en la NP.

Evaluación de las características de liberación de isoniazida a partir de un biomaterial cerámico

La tuberculosis es un serio problema de salud pública, esta enfermedad representa la segunda causa de muerte ocasionada por un agente infeccioso. Una de las razones de la elevada tasa de morbi-mortalidad es la multifarmacorresistencia desarrollada por la bacteria, dicha resistencia es más frecuente en infecciones que requieren un tratamiento prolongado, lo cual conduce a mayor riesgo de incumplimiento por parte del paciente. Considerando la problemática asociada al tratamiento de la tuberculosis, el desarrollo de un sistema que libere isoniazida de manera sostenida representa una forma para mejorar el cumplimiento de la terapia, permitiendo mantener las concentraciones plasmáticas del fármaco en el rango terapéutico y reducir el riesgo de desarrollo de resistencia por el Mycobacterium tuberculosis. Contribuciones y Conclusiones: En el presente trabajo de investigación se evaluaron las características de liberación de la isoniazida incorporada en una matriz cerámica a base de SiO2 a condiciones fisiológicas in vitro. La síntesis del biomaterial se realizó vía sol-gel a diferentes condiciones de pH y relación TEOS/Agua. El material cerámico conteniendo la isoniazida fue caracterizado mediante técnicas térmicas, espectrométricas y microscópicas. Se realizaron pruebas de extracción para determinar la incorporación de isoniazida en el biomaterial, así como ensayos in vitro para evaluar las características de liberación de isoniazida en solución acuosa a pH fisiológico y mediante la determinación de permeabilidad en membranas artificiales. La cinética de liberación a pH fisiológico ocurrió en dos fases y esta dependió directamente de la morfología y de las propiedades texturales de la matriz, el factor más importante fue la porosidad, mientras que el estudio de permeabilidad de isoniazida en membranas artificiales indica que no se ve afectada cuando esta se incorporó en los biomateriales.