Construcción y evaluación de un promotor eucariótico que controla la expresión de genes heterólogos en condiciones de hipoxia

La hipoxia es una característica común en los tumores sólidos, contribuyendo local y sistémicamente a la progresión tumoral, además de la falta de respuesta a la radioterapia y quimioterapia. La presencia de regiones hipóxicas en neoplasias malignas es uno de los factores predictivos más importantes, debido a que induce una amplia gama de respuestas fisiológicas y desempeña un papel crucial en la patogénesis de varias enfermedades humanas. Paradójicamente la hipoxia también es un blanco terapéutico atractivo ya que se produce hipoxia severa solo en el tejido del tumor sólido. El sistema de regulación HRE/HIF1 es común en todas las células de mamíferos y tejidos humanos, se puede utilizar para lograr la expresión selectiva de genes terapéuticos en condiciones de hipoxia. Cuando HREs derivados de diferentes genes se colocan en plásmidos y sistemas de vectores virales, confieren inducibilidad hipóxica sobre los promotores heterólogos en varios tipos de células por lo que la hipoxia puede ser explotada para el tratamiento de cáncer selectivo. En el presente trabajo se creó y caracterizó el vector hipóxico pHRE-Luc y se comprobó su funcionalidad en la línea celular B16F10 mediante la medición de la expresión génica del gen reportero luciferasa en condiciones de hipoxia y normoxia bajo la influencia de 6 copias de elementos sensible a la hipoxia (HRE) del gen de la eritropoyetina (Epo). Los resultados muestran que en condiciones de hipoxia, el vector pHRE-Luc (6HRE-Luc) fue 4 veces más eficiente que en normoxia para inducir la expresión génica. Este vehículo proporciona las bases para plantear un sistema sitio dirigido a las regiones hipóxicas de los tumores para terapia génica específica del cáncer.

Análisis de la expresión de miRNAs en trofozoítos de entamoeba histolytica.

Entamoeba histolytica representa una de las principales causas a nivel mundial de muertes por parasitosis. Aunque se ha identificado como el agente causal de la amibiasis desde 1875, los mecanismos moleculares por los cuales este parásito causa la enfermedad aún no estan completamente comprendidos. Los microRNAs (miRNAs) son grupos de RNAs pequeños no codificantes que juegan un papel importante en la regulación de la expresión de genes y la traducción de proteínas en una gran variedad de organismos. Su identificación ha sido un paso importante para facilitar y entender la biología, organización y evolución del genoma, así como su regulación posttranscripcional, sin embargo en E. histolytica no se tiene registro de la presencia de estas moléculas reguladoras. En nuestro laboratorio a partir de un cultivo de trofozoitos de E. histolytica en condiciones axénicas se aislaron los RNA totales y se purificaron en una fracción de 15 a 50 nucleótidos los cuales se utilizaron para construir una biblioteca de RNAs pequeños que posteriormente fueron secuenciados y en donde se detectaron 199 miRNAs exclusivos para este parásito. Durante el desarrollo de esta tesis, se analizó la expresión de miRNAs en trofozoítos de E. histolytica HM1-IMSS, usando la técnica de microarreglo µParaflo Microfluidic Biochip Technology y posteriormente se realizó la verificación de la expresión de los miRNAs mediante RT-PCR Tiempo Real. Los resultados del microarreglo demostraron la expresión 41 candidatos a miRNAs de los cuales se confirmó la presencia de 9 microRNAs de E. histolytica (Ehi-miRNAs) mediante RT-PCR Tiempo Real. La estructura de los Ehi-miRNAs permitió predecir 32 probables genes blanco ya descritos y 34 genes hipotéticos probables. Los resultados obtenidos postulan una colección de miRNAs reguladores en E. histolytica que generan una plataforma para analizar molecularmente la estructura genómica, regulación génica y validación de los Ehi-miRNAs en este parásito

Evaluación antimicrobiana de rifampicina nanoencapsulada contra aggregatibacter actinomycetemcomitans presente en la periodontitis

Introducción. A pesar de los esfuerzos tanto de la medicina como de la industria farmacéutica, el incremento en la prevalencia de resistencia en bacterias patógenas frente a antibióticos se ha vuelto uno de los mayores problemas en la medicina moderna. El área odontológica tampoco se encuentra exenta, siendo común el uso excesivo de antibióticos lo que contribuye al desarrollo de resistencia antimicrobiana. La primera etapa para el desarrollo de la enfermedad periodontal es la formación de un biofilm de bacterias periodontopatógenas, siendo el Aggregaribacter actinomycetemcomitans (A.a) uno de los más asociados a dicha enfermedad. El tratamiento de esta patología se basa en remover mecánicamente la placa dentobacteriana y, en segunda instancia, en el apoyo de terapia antimicrobiana para coadyuvar la eliminación de las bacterias periodontopatógenas, cuales tienen gran similitud con Mycobacterium tuberculosis. La rifampicina es uno de los antibióticos efectivos contra bacterias multi-resistentes y la primera elección en el tratamiento de tuberculosis activa. Con el fin de mejorar la terapia farmacológica y evadir la resistencia del agente infectivo, se han propuesto nuevas estrategias basadas en sistemas de liberación controlada. Entre los más estudiados en los últimos 10 años se encuentran las nanopartículas poliméricas. El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad antimicrobiana de la rifampicina nanoencapsulada contra el A.a presente en la periodontitis. Materiales y Métodos. Para el estudio, Se tomaron muestras de fluido crevicular en pacientes con bolsas periodontales de 5-10 mm de profundidad. Se inoculo caldo de tripticaseina de soya (TCS) con las muestras tomadas y se incubaron a 37 ° C en condiciones aeróbicas por 7 días. La presencia de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a) fue determinado mediante PCR en tiempo real. La Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) de rifampicina para interferir con el crecimiento de bacterias orales fue determinada mediante la técnica de dilución de tubos. Posteriormente se prepararon mediante la técnica de nanoprecipitación NP de Eudragit® EPO, L100-55 y PLA entre 100 y 200 nm y su IP con distribución de tamaño homogéneo. Resultados. A.a fue detectado en muestras de fluido crevicular en pacientes con periodontitis, corroborando su asociación con dicha patología. La efectividad de la rifampicina libre contra bacterias orales fue confirmada, obteniéndose una CMI de 1 µg/ml. Las NP con Rifampicina se ajustaron a la misma CMI que la Rif libre. Las NP de Eudragit® EPO cargadas con Rif mostraron que la liberación de la Rif de la NP fue inmediata, mientras que el Eudragit® L100-55 y PLA con Rif no mostró inhibición durante los 5 días de incubación. Esto hace suponer que el fármaco no fue liberado o solo se liberó en una baja proporción que no permitió llegar a la CMI. Conclusión. La rifampicina es una excelente alternativa terapéutica para el tratamiento de la enfermedad periodontal, promoviendo resultados favorables en la evaluación clínica de pacientes. Sería interesante continuar con estudios utilizando otro polímero o mezcla de ellos para favorecer la liberación del fármaco en la NP.