Evaluación de las características de liberación de isoniazida a partir de un biomaterial cerámico

La tuberculosis es un serio problema de salud pública, esta enfermedad representa la segunda causa de muerte ocasionada por un agente infeccioso. Una de las razones de la elevada tasa de morbi-mortalidad es la multifarmacorresistencia desarrollada por la bacteria, dicha resistencia es más frecuente en infecciones que requieren un tratamiento prolongado, lo cual conduce a mayor riesgo de incumplimiento por parte del paciente. Considerando la problemática asociada al tratamiento de la tuberculosis, el desarrollo de un sistema que libere isoniazida de manera sostenida representa una forma para mejorar el cumplimiento de la terapia, permitiendo mantener las concentraciones plasmáticas del fármaco en el rango terapéutico y reducir el riesgo de desarrollo de resistencia por el Mycobacterium tuberculosis. Contribuciones y Conclusiones: En el presente trabajo de investigación se evaluaron las características de liberación de la isoniazida incorporada en una matriz cerámica a base de SiO2 a condiciones fisiológicas in vitro. La síntesis del biomaterial se realizó vía sol-gel a diferentes condiciones de pH y relación TEOS/Agua. El material cerámico conteniendo la isoniazida fue caracterizado mediante técnicas térmicas, espectrométricas y microscópicas. Se realizaron pruebas de extracción para determinar la incorporación de isoniazida en el biomaterial, así como ensayos in vitro para evaluar las características de liberación de isoniazida en solución acuosa a pH fisiológico y mediante la determinación de permeabilidad en membranas artificiales. La cinética de liberación a pH fisiológico ocurrió en dos fases y esta dependió directamente de la morfología y de las propiedades texturales de la matriz, el factor más importante fue la porosidad, mientras que el estudio de permeabilidad de isoniazida en membranas artificiales indica que no se ve afectada cuando esta se incorporó en los biomateriales.

Producción y caracterización de la superóxido dismutasa a (SodA) de nocardia brasiliensis en pichia pastoris

Introducción: A mediados de los años 70’s del siglo pasado el descubrimiento de la tecnología del ADN recombinante marca el inicio de la era de la biotecnología moderna. La implementación de estas tecnologías permitió la utilización de organismos como sistemas de expresión que a lo largo de los años ha generado la producción de una gran variedad de productos biológicos. Dentro de estos sistemas Pichia pastoris es un sistema de expresión ampliamente utilizado debido a sus características tales como la producción de proteínas en grandes cantidades, la liberación de los productos al medio de cultivo, la obtención de productos complejos que requieren modificaciones postraduccionales típicas de los eucariotas o que contienen puentes disulfuro, entre otras. Nocardia brasiliensis es una bacteria parcialmente ácido-alcohol resistente la cual forma colonias granulares, con hifas aéreas escasas, sus colonias exhiben un color anaranjado pardo con bordes en blanco. N. brasiliensis es patógena para el ser humano y es el agente causal del actinomicetoma. El actinomicetoma es una enfermedad crónica generalmente localizada en las extremidades. Se caracteriza por ser un proceso lento de tumefacción con nódulos, abscesos y fístulas.La Superóxido Dismutasa (SOD) es una enzima reductora polimérica que cataliza la conversión del ión superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular. La SOD ha sido propuesta como un factor de virulencia de microorganismos patógenos, cuya acción consiste en bloquear los efectores oxidativos del estallido respiratorio iniciado por los fagocítos en el fagolisosoma. Este mecanismo ha sido descrito para bacterias de los géneros Mycobacterium, Rhodococcus y Nocardia. Objetivo: producir y caracterizar la Superóxido Dismutasa A (SODA) de Nocardia brasiliensis en Pichia pastoris. Metodología: se realizó el diseño de primers adicionando secuencias de sitios de corte para las enzimas XhoI y AvrII, así como una cola de histidinas en el extremo 5’ para la amplificación del gen sodA de N. brasiliensis a partir del ADN genómico de Nocardia brasiliensis. El amplicón se clonó en el vector de expresión pPIC9. Se llevó a cabo la transformación por electroporación de levaduras Pichia pastoris GS115. La producción de SOD se llevó a cabo en inducciones de 96 h con metanol como agente inductor. Los sobrenadantes se dializaron con membranas de celulosa. Los dializados se observaron por SDS-PAGE y western blot. Se analizó la actividad funcional de la enzima con el SOD Assay kit de Sigma Aldrich. Resultados: Por reacción en cadena de la polimerasa se obtuvo una secuencia de 625 pb correspondiente al gen sodA. El fragmento se ligó al vector de expresión pPIC9 y fue caracterizado con las enzimas de restricción XhoI y AvrII. Las cepas trasformadas de P. pastoris GS115 se caracterizaron con el gen aox1 obteniendo cepas Mut+ y Muts. Los análisis por SDSPAGE mostraron bandas no observadas en el control negativo de expresión mientras en los western blot solo una de las clonas mostró señal. Los análisis de actividad funcional sugieren inhibición de la reacción enzimática infiriendo presencia de la proteína SOD en el medio dializado. Conclusiones: Se logró la construcción del sistema de expresión Pichia pastoris con el casete de expresión de la SOD de N. brasiliensis. Así como la generación de cepas Mut+y Muts. En los ensayos de actividad funcional se observó inhibición de la reacción enzimática.

Evaluación del efecto citopático inducido por un adenovirus oncolítico en una línea celular murina utilizada como modelo de cáncer cervical

Los adenovirus oncolífticos ofrecen un tratamiento muy prometedor para combatir al cáncer. Estos virus se replican pobremente en células de ratón, por lo que para evaluar su eficacia para destruir tumores, usualmente se implantan células tumorales humanas en las cuales se replican los virus, pero con el inconveniente que se deben usar ratones inmunosuprimidos, para evitar que su sistema inmune elimine estas células por ser de diferente especie. Sin embargo, estos ratones no representan un modelo adecuado para evaluar la eficacia terapéutica de dichos adenovirus en ensayos preclfnicos, ya que carecen de mecanismos de defensa propios del sistema inmune que pudiesen coadyuvar en la protección contra el tumor y/o eliminación del adenovirus. Actualmente no existe un modelo de cáncer de cervix en ratones silvestres (inmunocompetentes) en los cuales los tumores se desarrollen a partir de celulas murinas y que los virus oncolfticos se repliquen eficientemente, al igual que en las células humanas, y se permita evaluar su efecto antitumoral. Se ha demostrado que los genes E6 y E7 del HPV-16 facilitan la replicación de los adenovirus. En este trabajo por primera vez se evalu6 1a capacidad de replicación de un adenovirus oncolftico en Ia lfrrea celular murina TC-1 Ia cual posee los genes E6 y E7 del HPV-16. Demostramos que el adenovirus oncolitico Adhz60 indujo en Ia lfnea TC-1 un efecto citopatico evidente, disminuye importantemente su viabilidad celular, indujo la expresión de proteínas virales tempranas y tardas, fue capaz de generar una progenie viral infectiva y de inducir apoptosis. Contribuciones y Conclusiones. Con nuestros resultados demostramos que la linea celular murina TC-1 es permisiva para la replican del virus oncolftico Adhz60. Por lo tanto, las células TC-1 pueden ser usadas como modelo tumoral para evaluar adenovirus oncoliticos en ratones inmunocompetentes.