Producción y caracterización de la superóxido dismutasa a (SodA) de nocardia brasiliensis en pichia pastoris

Introducción: A mediados de los años 70’s del siglo pasado el descubrimiento de la tecnología del ADN recombinante marca el inicio de la era de la biotecnología moderna. La implementación de estas tecnologías permitió la utilización de organismos como sistemas de expresión que a lo largo de los años ha generado la producción de una gran variedad de productos biológicos. Dentro de estos sistemas Pichia pastoris es un sistema de expresión ampliamente utilizado debido a sus características tales como la producción de proteínas en grandes cantidades, la liberación de los productos al medio de cultivo, la obtención de productos complejos que requieren modificaciones postraduccionales típicas de los eucariotas o que contienen puentes disulfuro, entre otras. Nocardia brasiliensis es una bacteria parcialmente ácido-alcohol resistente la cual forma colonias granulares, con hifas aéreas escasas, sus colonias exhiben un color anaranjado pardo con bordes en blanco. N. brasiliensis es patógena para el ser humano y es el agente causal del actinomicetoma. El actinomicetoma es una enfermedad crónica generalmente localizada en las extremidades. Se caracteriza por ser un proceso lento de tumefacción con nódulos, abscesos y fístulas.La Superóxido Dismutasa (SOD) es una enzima reductora polimérica que cataliza la conversión del ión superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular. La SOD ha sido propuesta como un factor de virulencia de microorganismos patógenos, cuya acción consiste en bloquear los efectores oxidativos del estallido respiratorio iniciado por los fagocítos en el fagolisosoma. Este mecanismo ha sido descrito para bacterias de los géneros Mycobacterium, Rhodococcus y Nocardia. Objetivo: producir y caracterizar la Superóxido Dismutasa A (SODA) de Nocardia brasiliensis en Pichia pastoris. Metodología: se realizó el diseño de primers adicionando secuencias de sitios de corte para las enzimas XhoI y AvrII, así como una cola de histidinas en el extremo 5’ para la amplificación del gen sodA de N. brasiliensis a partir del ADN genómico de Nocardia brasiliensis. El amplicón se clonó en el vector de expresión pPIC9. Se llevó a cabo la transformación por electroporación de levaduras Pichia pastoris GS115. La producción de SOD se llevó a cabo en inducciones de 96 h con metanol como agente inductor. Los sobrenadantes se dializaron con membranas de celulosa. Los dializados se observaron por SDS-PAGE y western blot. Se analizó la actividad funcional de la enzima con el SOD Assay kit de Sigma Aldrich. Resultados: Por reacción en cadena de la polimerasa se obtuvo una secuencia de 625 pb correspondiente al gen sodA. El fragmento se ligó al vector de expresión pPIC9 y fue caracterizado con las enzimas de restricción XhoI y AvrII. Las cepas trasformadas de P. pastoris GS115 se caracterizaron con el gen aox1 obteniendo cepas Mut+ y Muts. Los análisis por SDSPAGE mostraron bandas no observadas en el control negativo de expresión mientras en los western blot solo una de las clonas mostró señal. Los análisis de actividad funcional sugieren inhibición de la reacción enzimática infiriendo presencia de la proteína SOD en el medio dializado. Conclusiones: Se logró la construcción del sistema de expresión Pichia pastoris con el casete de expresión de la SOD de N. brasiliensis. Así como la generación de cepas Mut+y Muts. En los ensayos de actividad funcional se observó inhibición de la reacción enzimática.

El papel de la angiogénesis en la patogenia del actinomicetoma por nocardia brasiliensis

Objetivo: Investigar el papel de la angiogénesis durante el desarrollo del actinomicetoma y sobre el actinomicetoma establecido en un modelo experimental. Material y métodos: se determinó si el fenofibrato inhibe el crecimiento de la bacteria mediante la técnica de microdilución en placa. Se administró una suspensión de fenofibrato vía orogástrica cada 24 h durante el establecimiento del actinomicetoma y sobre el actinomicetoma establecido en ratones BALB/c infectados con la cepa N. brasiliensis HUJEG-1 (ATCC 700358). El tratamiento en ambos casos tuvo una duración de 45 días, tiempo en el que se evaluaron las diferencias en inflamación y la evolución clínica de las lesiones, empleando un vernier y la ecuación elipsoidea. También se realizó el análisis histológico en el sitio de la infección mediante tinciones con hematoxilina y eosina. El proceso de angiogénesis fue evaluado a diferentes tiempos en la administración del tratamiento mediante inmunohistoquímica, buscando como marcadores de vasos sanguíneos las moléculas VEGF, eNOS, y LYVE-1, este último como un marcador indirecto del proceso angiogénico. Resultados: se comprobó que el fenofibrato no inhibe el crecimiento de la bacteria a la concentración correspondiente a EC50 en ratones. Las lesiones características de la enfermedad se desarrollaron en un menor número de ratones que recibieron el tratamiento de fenofibrato, durante el establecimiento del actinomicetoma y sobre el actinomicetoma establecido. Además, se observó una disminución en las medidas de inflamación y en la aparición de lesiones histológicas, así como una disminución en el número de vasos sanguíneos en los sitios de la infección. Conclusiones: La angiogénesis contribuye a la patogenia del actinomicetoma por N. brasiliensis; la disminución de la formación de vasos sanguíneos por el tratamiento con fenofibrato limita el grado de la lesión.