Detección de proteínas urinarias por iTRAQ asociadas a complicaciones del trasplante renal y su modificación con la terapia

Propósito y Método del Estudio: Determinar los perfiles de expresión de proteínas en orina en pacientes agrupados de acuerdo a las complicaciones presentadas post trasplante (TR) y detectar su variación al modificar la terapia. Fue un estudio observacional, longitudinal, analítico y retrospectivo. Se incluyeron pacientes que fueron sometidos a trasplante y estuvieron de acuerdo en participar en el protocolo. Se recolectaron muestras de orina pretrasplante y cada tercer día desde el momento del trasplante. Las muestras fueron almacenadas a -70ºC hasta el momento de su análisis por marcaje peptídico mediante isótopos isobáricos para la cuantificación relativa (iTRAQ). Se agrupó a los pacientes con complicaciones por infección confirmado por cultivos y rechazo agudo confirmado por biopsia. Se establecieron 4 fases de estudio: pre trasplante, post TR previo a complicación, post TR con complicación en curso y post TR complicación tratada. Contribuciones y Conclusiones: De Enero de 2009 a Mayo de 2013 se incluyeron a 22 pacientes: 10 mujeres (45%) y 12 hombres (55%) con una edad promedio de 45+ 15 años. Solo 12 pacientes presentaron complicaciones en el post TR: 2 pacientes con rechazo agudo al injerto (GR) (1hombre, 1 mujer); y 10 pacientes (6 hombres, 4 mujeres) en el grupo de infecciones (GI). Para el análisis por iTRAQ se hizo la cuantificación relativa comparando la presencia de las proteínas en las diferentes fases de estudio. Para el grupo de rechazo agudo, se encontraron 345 proteínas, de las cuales solo 15 cumplieron los criterios de aceptación de la técnica (score >30, > 2 péptidos identificados con el 95% de confianza). Para el grupo de infecciones se encontraron 113 de las cuales 28 cumplieron los criterios de aceptación de la técnica. Conclusiones: La albúmina fue la única proteína encontrada en ambos grupos de estudio, el resto de las proteínas 14 en el GR y 27 en GI fueron diferentes. Las 5 proteínas con mayor scores en GR fueron alfa 1 microglobulina, 5' nucleosidasa citosólica, Proteína 4 de unión a retinol, proteína de membrana 4 palmitolada y serin carboxipeptidasa mientras que en GI: acetil coenzima A sintetasa mitocondrial, adenosil homocisteinasa 2, proteína de dedo de zinc GLIS1isoforma X1, proteína putativa de la isoforma FAM157B, proteína de dedo de zinc 615 isoforma X6. Queda por dilucidar la participación de cada una de éstas en los pacientes con trasplante renal.

Análisis transcripcional de la vía de secreción y metabolismo del metanol durante la producción de una proteína heteróloga en Pichia pastoris

La levadura metilotrófica Pichia pastoris es de gran importancia industrial principalmente en la producción de proteínas heterólogas. En un estudio reciente se emplearon cinco factores ambientales para definir condiciones de cultivo a nivel de bioreactor que condujeron a altos (CM) y bajos (CP) niveles de la producción extracelular de una fitasa recombinante en una cepa Muts de P. pastoris. Los resultados de este estudio mostraron que bajo las condiciones CM, la demanda y consumo de O2 y de metanol fueron más altos y condujeron a valores más altos en la velocidad específica de crecimiento (μ), biomasa (2.7 veces), niveles de producción de fitasa extracelular (5.5 veces) y rendimientos (Yp/x) que en CP. Con el fin de comprender los mecanismos de regulación transcripcional que afectan a la fisiología de P. pastoris por la sobre-producción de la proteína recombinante y las condiciones de cultivo, en este trabajo se realizó un análisis de expresión diferencial de genes (DGE) empleando la tecnología de secuenciación masiva de mRNA (RNAseq) de la cepa Muts de P. pastoris crecida bajo las condiciones CM y CP reportadas previamente. Además se validaron los resultados del estudio de DGE mediante RT-qPCR. Resultados: La expresión de 4,950 genes, el 93% de los genes totales anotados, fueron detectados. Se sub- y sobre-expresaron 350 y 413 genes respectivamente en CM respecto a CP. En CM vs CP se sobre-expresaron significativamente términos relacionados con la biosíntesis de aminoácidos, biosíntesis de nucleósidos de purina, regulación de la traducción, glicosilación de proteínas y mitosis, indicando una mayor actividad anabólica en CM. La transcripción del gen heterólogo y de los genes de la ruta de desasimilación del metanol no mostraron diferencias entre ambas condiciones de cultivo y fue inducida en metanol. Sin embargo las enzimas claves (DAS1 y DAS2) de la ruta de asimilación del metanol se sobre-expresaron significativamente en CM vs CP, indicando que CM está favorecida la producción de biomasa y la generación de energía a través de esta vía, explicando los valores más altos para la μ y biomasa obtenidos en CM respecto a CP. De 110 genes analizados involucrados en la vía de secreción, 20 se sobre-expresaron en CM vs CP, la sobre-expresión de estos genes indicaron que bajo las condiciones de CM, se presenta una mayor actividad transcipcional de los genes implicados en el transporte y translocación hacia el RE (15%), genes implicados en el plegamiento de proteínas en RE (25%), así como genes relacionados en el procesamieto de las proteínas a través del RE (30%) y Golgi (35%) que permitieron un estado fisiológico favorable para la secreción de la proteína heteróloga. De los 44 genes relacionados con el estrés en RE durante la secreción, en CM vs CP se sobre-expresaron genes UPR indicando, que bajo condiciones de CM, se promueve la expresión de genes relacionados con el plegamiento de proteínas y probablemente se evita el acumulamiento de proteínas mal plegadas. La sub-expresión de todos los genes relacionados con autofagia, es uno de los factores que podría explicar la menor actividad proteolítica observada en CM. Finalmente se observó una correlación entre los métodos de RNA-seq y RTqPCR (r2=0.7). Conclusiones: El análisis de la DGE señala que los factores ambientales en CM condujeron a la regulación de la expresión de genes del proceso de secreción y genes relacionados al estrés en RE durante la secreción que condujeron a valores de Yp/x, más altos en CM que en CP y no se atribuyen a una expresión diferencial del gen heterólogo. La regulación de la ruta del metanol hacia la asimilación y una mejor respuesta de adaptación al estrés en CM condujeron a un mayor crecimiento y producción de biomasa en CM que en CP.

Análisis de la expresión de miRNAs en trofozoítos de entamoeba histolytica.

Entamoeba histolytica representa una de las principales causas a nivel mundial de muertes por parasitosis. Aunque se ha identificado como el agente causal de la amibiasis desde 1875, los mecanismos moleculares por los cuales este parásito causa la enfermedad aún no estan completamente comprendidos. Los microRNAs (miRNAs) son grupos de RNAs pequeños no codificantes que juegan un papel importante en la regulación de la expresión de genes y la traducción de proteínas en una gran variedad de organismos. Su identificación ha sido un paso importante para facilitar y entender la biología, organización y evolución del genoma, así como su regulación posttranscripcional, sin embargo en E. histolytica no se tiene registro de la presencia de estas moléculas reguladoras. En nuestro laboratorio a partir de un cultivo de trofozoitos de E. histolytica en condiciones axénicas se aislaron los RNA totales y se purificaron en una fracción de 15 a 50 nucleótidos los cuales se utilizaron para construir una biblioteca de RNAs pequeños que posteriormente fueron secuenciados y en donde se detectaron 199 miRNAs exclusivos para este parásito. Durante el desarrollo de esta tesis, se analizó la expresión de miRNAs en trofozoítos de E. histolytica HM1-IMSS, usando la técnica de microarreglo µParaflo Microfluidic Biochip Technology y posteriormente se realizó la verificación de la expresión de los miRNAs mediante RT-PCR Tiempo Real. Los resultados del microarreglo demostraron la expresión 41 candidatos a miRNAs de los cuales se confirmó la presencia de 9 microRNAs de E. histolytica (Ehi-miRNAs) mediante RT-PCR Tiempo Real. La estructura de los Ehi-miRNAs permitió predecir 32 probables genes blanco ya descritos y 34 genes hipotéticos probables. Los resultados obtenidos postulan una colección de miRNAs reguladores en E. histolytica que generan una plataforma para analizar molecularmente la estructura genómica, regulación génica y validación de los Ehi-miRNAs en este parásito