Expresión, purificación y caracterización de proteínas quiméricas de RsbP con el dominio sensorial Per‐ARNT‐Sim y dominios de respuesta histidina quinasa y fosfatasa

Los organismos monitorean una serie de señales internas y externas para ajustar su comportamiento frente a diferentes entornos. Las proteínas encargadas de la transducción de señales son llamadas proteínas sensoriales, y éstas contienen dominios sensoriales que son sensibles a las señales tales como la absorción de la luz o la unión de una sustancia química o ligando; y dominios de respuesta que poseen actividad biológica. Algunas proteínas sensoriales contienen dominios Per-­‐ARNT-­‐Sim(PAS), estos dominios son relativamente pequeños, de aproximadamente 110 aminoácidos y han sido reportados en todos los reinos de la vida. En proteínas, un dominio se caracteriza por una secuencia de aminoácidos específica, sin embargo, los dominios PAS difieren de esta definición, pero sí se caracterizan por poseer una estructura definida que consta de cinco plegamientos beta antiparalelos flanqueados por varias alfa hélices cuya estructura les permite detectar cambios físicos y químicos. Estos dominios pueden activar diferentes dominios de respuesta, que en bacterias incluyen a fosfatasa e histidina quinasa. Se planteó la siguiente hipótesis: El dominio Per-­‐ARNT-­‐Sim(PAS) de RsbP es capaz de interactuar con distintos dominios derespuesta, ya sea fosfatasa o histidina quinasa formando estructuras cuaternarias definidas. El objetivo general es: Establecer la relación estructura-­‐función de dominios PAS bacterianos determinando interacciones específicas con distintos dominios de respuesta. La metodología incluye las técnicas de clonación tradicionales, expresión y purificación de proteínas por medio de cromatografía por afinidad y por intercambio aniónico y finalmente el estudio del estado oligomérico por medio de cromatografía de exclusión. Contribuciones y Conclusiones: en el presente estudio se expresó, purificó y caracterizó el dominio sensorial PAS de RsbP (RsbP-­‐PAS) y la proteína completa RsbP de B. subtilis. Estas proteínas seexpresaron y purificaron utilizando la proteína glutatión S-­‐transferasa (GST) como proteína de fusión. Mediante cromatografía de exclusión por tamaño se determinó la estructura cuaternaria del dominio sensorial PAS de RsbP siendo un monómero y la proteína completa RsbP como tetrámero. Además en este estudio se llevó a cabo la construcción de dos proteínas quiméricas de RsbP. La primera esta compuesta de la siguiente manera, (RsbP-­‐PAS) como domino sensorial, bucle enrollado, el cual conecta al domino sensorial con el dominio de respuesta, e histidina quinasa (PAS-­‐HPK) como dominio de respuesta; y la segunda, (RsbP-­‐PAS) como domino sensorial, el primer dominio PAS del fitocromo A que conecta ambos dominios y fosfatasa como dominio de respuesta (PAS-­‐PASalt-­‐PPM). Estas proteínas se expresaron utilizando la proteína glutatión S-­‐transferasa como proteína de fusión la cual permite la purificación por afinidad. En el caso de PAS-­‐HPK se obtuvo suficiente proteína soluble, sin embargo,PAS-­‐PASalt-­‐HPK mostró la presencia de cuerpos de inclusión los cuales disminuyen el rendimiento de proteína soluble y dificultansu purificación. Es importante señalar que en estudios posteriores se mejorará la obtención de proteína soluble de las proteínas quiméricas, para mejorar sus rendimientos de purificación y su caracterización y de esta manera conocer el estado oligomérico que éstas presentan; para corroborar la teoría que el dominio PAS puede activar diferentes dominios de respuesta ya sea con la presencia del bucle enrollado y/o la presencia de dominios PAS alternos; y posteriormente determinar los mecanismos de transducción de señales que estos dominios presentan.

Relación estructura – luminiscencia en aductos de condensación aldólica

Considerando la importancia tecnológica de los materiales orgánicos luminiscentes y la necesidad de conocer el efecto de la estructura en la luminiscencia se determinó el efecto que tiene el número de dobles enlaces conjugados entre grupos aromáticos en compuestos modelo de condensación aldólica. Se observó también el efecto del cambio de acetona a ciclohexanona, que produce un corrimiento de la luminiscencia hacia el rojo. Se corroboró que la inclusión de cadenas hidrocarbonadas laterales mejora la solubilidad y se detectó el efecto del empaquetamiento en la longitud de onda de la luminiscencia.

Análisis transcripcional de la vía de secreción y metabolismo del metanol durante la producción de una proteína heteróloga en Pichia pastoris

La levadura metilotrófica Pichia pastoris es de gran importancia industrial principalmente en la producción de proteínas heterólogas. En un estudio reciente se emplearon cinco factores ambientales para definir condiciones de cultivo a nivel de bioreactor que condujeron a altos (CM) y bajos (CP) niveles de la producción extracelular de una fitasa recombinante en una cepa Muts de P. pastoris. Los resultados de este estudio mostraron que bajo las condiciones CM, la demanda y consumo de O2 y de metanol fueron más altos y condujeron a valores más altos en la velocidad específica de crecimiento (μ), biomasa (2.7 veces), niveles de producción de fitasa extracelular (5.5 veces) y rendimientos (Yp/x) que en CP. Con el fin de comprender los mecanismos de regulación transcripcional que afectan a la fisiología de P. pastoris por la sobre-producción de la proteína recombinante y las condiciones de cultivo, en este trabajo se realizó un análisis de expresión diferencial de genes (DGE) empleando la tecnología de secuenciación masiva de mRNA (RNAseq) de la cepa Muts de P. pastoris crecida bajo las condiciones CM y CP reportadas previamente. Además se validaron los resultados del estudio de DGE mediante RT-qPCR. Resultados: La expresión de 4,950 genes, el 93% de los genes totales anotados, fueron detectados. Se sub- y sobre-expresaron 350 y 413 genes respectivamente en CM respecto a CP. En CM vs CP se sobre-expresaron significativamente términos relacionados con la biosíntesis de aminoácidos, biosíntesis de nucleósidos de purina, regulación de la traducción, glicosilación de proteínas y mitosis, indicando una mayor actividad anabólica en CM. La transcripción del gen heterólogo y de los genes de la ruta de desasimilación del metanol no mostraron diferencias entre ambas condiciones de cultivo y fue inducida en metanol. Sin embargo las enzimas claves (DAS1 y DAS2) de la ruta de asimilación del metanol se sobre-expresaron significativamente en CM vs CP, indicando que CM está favorecida la producción de biomasa y la generación de energía a través de esta vía, explicando los valores más altos para la μ y biomasa obtenidos en CM respecto a CP. De 110 genes analizados involucrados en la vía de secreción, 20 se sobre-expresaron en CM vs CP, la sobre-expresión de estos genes indicaron que bajo las condiciones de CM, se presenta una mayor actividad transcipcional de los genes implicados en el transporte y translocación hacia el RE (15%), genes implicados en el plegamiento de proteínas en RE (25%), así como genes relacionados en el procesamieto de las proteínas a través del RE (30%) y Golgi (35%) que permitieron un estado fisiológico favorable para la secreción de la proteína heteróloga. De los 44 genes relacionados con el estrés en RE durante la secreción, en CM vs CP se sobre-expresaron genes UPR indicando, que bajo condiciones de CM, se promueve la expresión de genes relacionados con el plegamiento de proteínas y probablemente se evita el acumulamiento de proteínas mal plegadas. La sub-expresión de todos los genes relacionados con autofagia, es uno de los factores que podría explicar la menor actividad proteolítica observada en CM. Finalmente se observó una correlación entre los métodos de RNA-seq y RTqPCR (r2=0.7). Conclusiones: El análisis de la DGE señala que los factores ambientales en CM condujeron a la regulación de la expresión de genes del proceso de secreción y genes relacionados al estrés en RE durante la secreción que condujeron a valores de Yp/x, más altos en CM que en CP y no se atribuyen a una expresión diferencial del gen heterólogo. La regulación de la ruta del metanol hacia la asimilación y una mejor respuesta de adaptación al estrés en CM condujeron a un mayor crecimiento y producción de biomasa en CM que en CP.