Estudo e desenvolvimento de lipossomas com potencial para aplicação em base cosmética

A acne vulgar é uma das doenças cutâneas mais comuns, apresentando como um de seus fatores fisiopatológicos primários a colonização pelo microrganismo Propionibacterium acnes. Atualmente, têm-se buscado terapias alternativas para o combate ao P. acnes, destacando-se alguns ácidos graxos, como o ácido laúrico (LA). O LA é uma molécula pouco solúvel em água, sendo possível sua incorporação em lipossomas. Os lipossomas apresentam capacidade de encapsulação/ liberação de ativos e impedem a desidratação da pele, tornando-se ingredientes inovadores na área de cosméticos. Foram preparados lipossomas de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) contendo diferentes concentrações de LA, que variaram de 0 a 50% da concentração total em mol, em quatro pHs: 9,0, 7,4, 5,0 e 3,0. Nestes pHs o estado de protonação do LA muda variando de 0 a -1. Os lipossomas foram extrusados por filtros com poros de 100 nm de diâmetro visando à obtenção de vesículas unilamelares grandes (LUV). As LUV foram caracterizadas quanto a sua estabilidade em condições de prateleira, temperatura de transição de fase da bicamada, encapsulamento no interior aquoso, liberação do LA, difusão das vesículas na pele e seus aspectos morfológicos foram caracterizados por espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) e crio-microscopia eletrônica de transmissão. Estudos de estabilidade mostraram que independentemente da concentração de LA, as formulações são mais estáveis em pHs mais altos, quando LA está em sua maioria na forma de laurato. Os experimentos de DSC revelaram que em pHs 3,0 e 5,0 e concentrações maiores de LA, a interação deste ácido graxo com as bicamadas é favorecida, havendo um aumento da temperatura de transição de fase (Tm) e diminuição da cooperatividade. Análises de taxa de incorporação de sondas hidrofílicas confirmaram a presença de um compartimento aquoso interno para as vesículas de DPPC:LA. O LA conseguiu permear a pele no período avaliado e pouco LA foi liberado das vesículas em condições de temperatura ambiente. A morfologia das LUV se mostrou bem diferente da esperada e se observaram vesículas com mais de uma bicamada e outros formatos que não o esférico. Estes resultados podem auxiliar na otimização das condições para uma formulação que poderá ser usada no tratamento da acne, aumentando a eficácia do LA no sítio alvo.

Caracterização de rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados associados a quadros clínicos

Este estudo teve como objetivos (a) identificar mecanismos pelos quais rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados possam estar associados de maneira causal a determinados quadros clínicos e (b) contribuir para a compreensão dos mecanismos de formação desses rearranjos. Para isso, foram estudados 45 rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados (29 translocações, 10 inversões e seis rearranjos complexos), detectados em pacientes que apresentavam malformações congênitas, comprometimento do desenvolvimento neuropsicomotor ou déficit intelectual. Foram 31 rearranjos cromossômicos esporádicos, três familiais que segregavam com o quadro clínico e mais 11 rearranjos cromossômicos herdados de genitores fenotipicamente normais. Inicialmente os pontos de quebra desses rearranjos foram mapeados por hibridação in situ fluorescente (FISH). A busca por microdeleções e duplicações genômicas foi realizada por a-CGH. A investigação dos pontos de quebra prosseguiu com a aplicação da técnica de Mate-Pair Sequencing (MPS), que permite localizar as quebras em segmentos de 100 pb - 1 kb, na maioria dos casos. Para obter os segmentos de junção das quebras no nível de pares de bases, os segmentos delimitados por MPS foram sequenciados pelo método de Sanger. A análise por aCGH revelou microdeleções ou microduplicações localizadas nos cromossomos rearranjados, em 12 dos 45 pacientes investigados (27%). A análise de 27 rearranjos por MPS permitiu a caracterização dos pontos de junção das quebras. MPS expandiu o número de pontos de quebra, detectados por análise do cariótipo ou aCGH, de 114 para 156 (em resolução < 2kb, na maioria dos casos). O número de pontos de quebra/rearranjo variou de 2 a 20. Os 156 pontos de quebra resultaram em 86 variantes estruturais equilibradas e outras 32 variantes não equilibradas. Perdas e ganhos de segmentos submiscroscópicos nos cromossomos rearranjados constituíram a principal causa ou, provavelmente, contribuíram para o quadro clínico de 12 dos 45 pacientes. Em cinco desses 12 rearranjos foram detectadas por MPS a interrupção de genes já relacionados à doença, ou provável alteração de sua região reguladora, contribundo para o quadro clínico. Em quatro dos 33 rearranjos não associados a perdas ou ganhos de segmentos, a análise por MPS revelou a interrupção de genes que já foram anteriormente relacionados a doenças, explicando-se, assim, as características clínicas dos portadores; outro rearranjo pode ter levando alteração da expressão gênica de gene sensível a dosagem e ao quadro clínico. Um rearranjo cromossômico familial, identificado na análise após bandamento G como uma translocação equilibrada, t(2;22)(p14;q12), segregava com quadro de atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e dificuldade de aprendizado associados a dismorfismos. A combinação das análises por FISH, aCGH e MPS revelou que se tratava, na verdade, de rearranjo complexo entre os cromossomos 2, 5 e 22, incluindo 10 quebras. A segregação de diferentes desequilíbrios submicroscópicos em indivíduos afetados e clinicamente normais permitiu a compreensão da variabilidade clínica observada na família. Rearranjos equilibrados detectados em indivíduos afetados, mas herdados de genitores clinicamente normais, são, em geral, considerados como não tendo relação com o quadro clínico, apesar da possibilidade de desequilíbrios cromossômicos gerados por permuta desigual na meiose do genitor portador do rearranjo. Neste trabalho, a investigação de 11 desses rearranjos por aCGH não revelou perdas ou ganhos de segmentos nos cromossomos rearranjados. No entanto, a análise por aCGH da portadora de um desses rearranjos - inv(12)mat - revelou deleção de 8,7 Mb no cromossomo 8, como causa de seu fenótipo clínico. Essa deleção estava relacionada com outro rearranjo equilibrado também presente em sua mãe, independente da inversão. Para compreender os mecanismos de formação de rearranjos citogeneticamente equilibrados, investigamos os segmentos de junção no nível de pares de base. A análise por MPS que levou, na maioria dos casos, ao mapeamento dos pontos de quebras em segmentos <1kb permitiu o sequenciamento pelo método de Sanger de 51 segmentos de junções de 17 rearranjos. A ocorrência de blunt fusions ou inserções e deleções <10 pb, e a ausência de homologia ou a presença de micro homologia de 2 pb a 4 pb de extensão indicaram o mecanismo de junção de extremidades não homólogas (non-homologous end joinging; NHEJ), na maioria das 51 junções caracterizadas. As características de três dos quatro rearranjos mais complexos, com 17-20 quebras, indicaram sua formação pelo mecanismo de chromothripsis. Este estudo mostra a importância da análise genômica de variações de número de cópias por microarray, juntamente com o mapeamento dos pontos de quebra por MPS, para determinar a estrutura de rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados e seu impacto clínico. O mapeamento dos segmentos de junção por MPS, permitindo o sequenciamento pelo método de Sanger, foi essencial para a compreensão de mecanismos de formação desses rearranjos

Nanopartículas lipídicas sólidas e vesículas cataniônicas contendo ftalocianina de cloro alumínio aplicadas nos processos fotodinâmicos

O trabalho apresentado foi realizado em duas etapas independentes e baseou-se no estudo de diferentes sistemas nanométricos para viabilizar a aplicação da ftalocianina de cloro alumínio (ClAlPc) na terapia fotodinâmica (TFD) para o tratamento do câncer de pele do tipo melanoma. O fármaco fotossensibilizante (FS) utilizado apresenta propriedades físico-químicas que lhe permitem exercer sua atividade fotodinâmica com excelência, sem a interferência do cromóforo endógeno melanina existente nas células melanocíticas. Para driblar sua elevada hidrofobicidade, ClAlPc foi encapsulada em sistemas nanométricos para administração em meio fisiológico. Inicialmente nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) foram desenvolvidas por emulsificação direta, após um estudo de elaboração do diagrama de fases. O compritol foi o lipídio sólido escolhido para compor as NLS, com diferentes concentrações de ClAlPc. Todas as formulações desenvolvidas foram devidamente caracterizadas, com tamanho médio entre 100 e 200 nm, baixa polidispersão, potencial zeta adequadamente negativo (~|30| mV), drug loading de ClAlPc entre 76-94% (com pequena redução após 24 meses) e alta eficiência de encapsulação (E.E.). A morfologia arredondada das nanopartículas foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão e de força atômica. A estabilidade das NLS foi de 24 meses. A avaliação da cristalinidade do lipídio revelou a integração da ClAlPc à matriz lipídica da NLS, presença de estruturas polimórficas e grau de cristalinidade adequado, sem alterações após 24 meses. Nos estudos de difusão in vitro, observou-se que ftalocianina encapsulada nas NLS acumulam-se preferencialmente na epiderme e derme do que no estrato córneo, sem traços de permeação do ativo. Foi confirmado o caráter biocompatível das NLS sobre fibroblastos NIH-3T3. A ftalocianina encapsulada nas NLS não foi tóxica na linhagem de melanoma B16-F10 na ausência de luz, porém, apresentou excelente efeito fototóxico (0,75 ?g mL-1 de ClAlPc nanoencapsulada e irradiação entre 0,5 e 2,0 J cm-2), com redução da viabilidade celular de 87%. O segundo sistema de veiculação estudado foram as vesículas cataniônicas (VesCat), que se formam espontaneamente em água com o tensoativo TriCat 12. A obtenção das vesículas contendo ClAlPc envolve uma etapa adicional, para remoção de solvente orgânico, que foi aprimorada, reduzindo o tempo de produção em 55%. As VesCat/ClAlPc obtidas mantiveram suas propriedades físico-químicas e morfologia arredondada (confirmada por microscopia eletrônica de varredura), drug loading de 47% e alta E.E. Os resultados comprovaram que a aplicação desses dois sistemas nanométricos é altamente eficiente para aplicação da TFD no tratamento do câncer de pele do tipo melanoma ou outras doenças cutâneas, apresentando características favoráveis para avanços nos estudos de fase clínica e pré-clínica.

Aplicação de técnicas inteligentes com análise no domínio do tempo para reconhecimento de defeitos em motores de indução trifásicos

Os motores de indução trifásicos são os principais elementos de conversão de energia elétrica em mecânica motriz aplicados em vários setores produtivos. Identificar um defeito no motor em operação pode fornecer, antes que ele falhe, maior segurança no processo de tomada de decisão sobre a manutenção da máquina, redução de custos e aumento de disponibilidade. Nesta tese são apresentas inicialmente uma revisão bibliográfica e a metodologia geral para a reprodução dos defeitos nos motores e a aplicação da técnica de discretização dos sinais de correntes e tensões no domínio do tempo. É também desenvolvido um estudo comparativo entre métodos de classificação de padrões para a identificação de defeitos nestas máquinas, tais como: Naive Bayes, k-Nearest Neighbor, Support Vector Machine (Sequential Minimal Optimization), Rede Neural Artificial (Perceptron Multicamadas), Repeated Incremental Pruning to Produce Error Reduction e C4.5 Decision Tree. Também aplicou-se o conceito de Sistemas Multiagentes (SMA) para suportar a utilização de múltiplos métodos concorrentes de forma distribuída para reconhecimento de padrões de defeitos em rolamentos defeituosos, quebras nas barras da gaiola de esquilo do rotor e curto-circuito entre as bobinas do enrolamento do estator de motores de indução trifásicos. Complementarmente, algumas estratégias para a definição da severidade dos defeitos supracitados em motores foram exploradas, fazendo inclusive uma averiguação da influência do desequilíbrio de tensão na alimentação da máquina para a determinação destas anomalias. Os dados experimentais foram adquiridos por meio de uma bancada experimental em laboratório com motores de potência de 1 e 2 cv acionados diretamente na rede elétrica, operando em várias condições de desequilíbrio das tensões e variações da carga mecânica aplicada ao eixo do motor.

Potencial dos biflavonóides de Araucaria angustifolia (Bert.) O. Kuntze como antioxidantes e fotoprotetores

A Araucaria angustifolia é uma conífera endêmica das regiões sul e sudeste do Brasil sendo considerada uma espécie em extinção devido ao extenso extrativismo madeireiro. Atualmente, existem inúmeros projetos visando o reflorestamento e o uso sustentável deste pinheiro. Em vista destes pontos, o estudo das propriedades dos componentes das folhas com o intuito da utilização destes com fins comerciais tornou-se de extrema importância. As suas folhas foram submetidas à extração com solventes e foram identificados seis biflavonóides majoritários, dentre estes a amentoflavona e a ginkgetina, que são apontados como agentes contra inflamações e artrites. A fração rica de biflavonóides (BFF) extraída da araucaria foi testada frente a sua atividade em proteger contra danos em biomoléculas provocadas por espécies reativas de oxigênio, capacidade em quelar metais e proteção contra raios UV. A capacidade do BFF em proteger contra danos provocados por espécies reativas de oxigênio foi comparado com compostos conhecidamente antioxidantes, como o α-tocoferol, Trolox®, quercetina, rutina e com padrões de biflavonóides, a amentoflavona e ginkgetina. O BFF demonstrou que possui uma constante de supressão do 1O2 (50 x 106 M-1s-1), superior ao da quercetina (9 x 106 M-1s-1) e foi o mais eficiente na proteção contra quebras de simples fita em DNA plasmidial, provocado por esta espécie reativa. Ainda em relação à proteção de DNA plasmidial o BFF foi capaz de proteger também contra estes danos provocados através da reação de Fenton, apesar de não demonstrar a mesma eficiência da quercetina que mostrou ser um potente protetor destes danos. O BFF protegeu contra lipoperoxidação em lipossomos de fosfatidilcolina induzida por raios UV e reação de Fenton. Em análises realizadas com espectrometria de massas foi observada a formação de complexos destes biflavonóides com íons metálicos como ferro, cobre e alumínio que possuem um papel importante na formação de radicais livres. Em relação à capacidade fotoprotetora do BFF, este inibiu a formação de dímeros de pirimidina que são apontados como causadores de câncer de pele induzidos, principalmente por radiação UV-B. Esta ação protetora foi superior àquela conferida ao p-metoxicinamato de octila, um conhecido fotoprotetor. Com o intuito de permitir a solubilização do BFF em soluções aquosas e assim, avaliar a ação do BFF em células, incorporou-se o BFF em ciclodextrina. Essa inclusão favoreceu a incorporação de BFF em células CV1-P na concentração aproximada de 0,4 µg/ml após 24 horas de incubação. Essa concentração incorporada não demonstrou ser tóxica para as células no teste com MTT. Assim, o BFF tem despertado grande interesse em relação ao seu potencial na utilização nas mais variadas áreas como cosmética, alimentos e fitoterápicos.