Interactions of maize bushy stunt phytoplasma with the leafhopper vector, Dalbulus maidis (Delong and Wolcott) (Hemiptera: Cicadellidae) and associated microbiota

Phytoplasmas are bacteria with a persistent propagative transmission by insect vectors that generates direct and indirect interactions among them. In order to understand these interactions for maize bushy stunt phytoplasma (MBSP) and the leafhopper vector Dalbulus maidis (Hemiptera: Cicadellidae), two research lines were addressed. The first one aimed to determine the indirect effects of maize infection by MBSP on some biological and behavioral parameters of the vector, whereas a second line investigated direct interactions of the phytoplasma with D. maidis during its movement through the vector body following acquisition from plants, and associated microbiota. Indirect effects were investigated in choice experiments in which alighting and oviposition preferences by D. maidis were compared on healthy vs. MBSP-infected plants with variable incubation time (diseased plants with early and advanced symptoms, or still asymptomatic). Likewise, indirect effect of MBSP on the D. maidis biology was determined in two life table experiments in which the vector was reared on healthy vs. MBSP-infected plants expressing advanced disease symptoms or still asymptomatic. Choice experiments showed that alighting and oviposition preferences of D. maidis on MBSP-infected plants compared to healthy plants depend on the pathogen incubation period in the plant. The leafhopper preferred MBSP-infected plants over healthy ones during the asymptomatic phase of the disease, but rejected infected plants with advanced symptoms. The vector was able to acquire MBSP from asymptomatic infected plants shortly (3 days) after inoculation, but transmission efficiency increased when acquisition occurred at later stages of the pathogen incubation period (≥14 days) in the source plants and the test plants showed disease symptoms faster. These results suggest that MBSP modulates D. maidis preference for asymptomatic infected plants in the early stages of the crop, allowing rapid spread of this pathogen. Maize infection by the phytoplasma had a neutral effect on most life table parameters of D. maidis; a lower net reproductivity rate (Ro) was observed in the cohort reared on MBSP-infected plants with advanced symptoms, which was compensated to some extent by a higher sexual ratio. MBSP acquisition by all vector nymphal stadia was confirmed by PCR, and the pathogen as detected in both male and female reproductive organs. Concerning direct MBSP-vector interactions, transmission electron microscopy analyses showed phytoplasma-like cells in the midgut lumen, microvilli and epithelial cells, suggesting that MBSP enters the epithelium midgut through the microvilli wall. Within the epithelial cells, mitochondria and bacteria-like cells (possibly endosymbionts) were observed together with masses of phythoplasma-like cells. In the hemocoel, phytoplasma-like cells grouped into a matrix were also observed in association with bacteria-like cells similar to those observed in the midgut epithelium. Similar associations were found in the salivary gland. Interestingly, in-situ hybridization (FISH) technique revealed a variation in diversity and abundance of the microbiota in intestine and salivary glands of D. maidis adults over time after MBSP acquisition from plants. Sulcia sp., Cardinium sp. and eubacteria increased their abundance over time, whereas Rickettsia sp. decreased. The frequent association of the vector microbiota with the phytoplasma in some tissues of D. maidis suggests that endosymbiotic bacteria may play some role in MBSP-vector interactions.

Caracterização da anemia em cadelas com piometra

A piometra é uma condição mórbida caracterizada pela inflamação do útero com acúmulo de exsudatos, resultante de ações hormonais e geralmente associada à presença de bactérias no lúmen uterino. A anemia é a alteração hematológica mais frequentemente observada em cadelas com piometra e está associada à cronicidade da doença, diminuição da eritropoiese, devido ao efeito toxêmico na medula óssea, diminuição da disponibilidade de ferro ou perda de sangue para o útero. Adicionalmente, o efeito das toxinas bacterianas e os radicais livres gerados pelo metabolismo oxidativo dos neutrófilos podem resultar na modificação da estrutura antigênica da membrana do eritrócito, permitindo a ligação de imunoglobulinas em sua superfície e acelerando a destruição eritrocitária. Essa hipótese pode ser comprovada pela detecção de imunocomplexos na superfície eritrocitária de cadelas com piometra. O diagnóstico de piometra foi estabelecido em 33 cadelas atendidas no Serviço de Obstetrícia/Ginecologia do Hospital Veterinário da Universidade de São Paulo com base na anamnese, exame físico e exames subsidiários (ultrassonografia, hemograma e concentrações séricas de ureia e creatinina). As amostras sanguíneas foram coletadas em dois momentos. A primeira anterior a ovariosalpingohisterectomia (OSH) e a segunda, sete a dez dias após a OSH. A quantificação de hemácias com deposição de imunocomplexos IgG e IgM foi realizada utilizando-se anticorpos anti-IgG e anti-IgM (Bethyl®Laboratories) conjugadas a fluoresceína de isotiocianato (FITC), e a leitura realizada com citômetro de fluxo (FACS Calibur; Becton, Dickinson and Company© 2007 BD), sendo os resultados expressos em percentual de hemácias marcadas. Foram utilizados o Teste de Shapiro-Wilk para a avaliação da distribuição de dados e a comparação entre os grupos controle, pré e pós-OSH foi realizada valendo-se do Teste t ou Teste t pareado e Correlação de Pearson, e do Teste U de Mann-Whitney e Correlação de Spearman, para as variáveis com distribuição normal e não-normal, respectivamente. O valor de alfa estipulado foi de 0,05. Analisando os valores hematológicos de cada um dos cães incluídos no estudo, observa-se que 19 (57,6%) apresentavam anemia normocítica normocrômica não regenerativa no momento pré-OSH e cinco (15,2%) no momento pós-OSH. Em cães do grupo controle foram observadas 0,14 - 0,77% (0,43±0,18%) de hemácias marcadas com anticorpos anti-IgG FITC e 0,29 - 9,58% (0,68±0,29%) para anticorpos anti-IgM FITC. Já nos cães com piometra, foram encontradas 0,14 - 4,19% (0,96±0,86%) de hemácias marcadas com anticorpos anti-IgG FITC e 0,29 - 9,58% (1,37±1,71%) com anticorpos anti-IgM FITC, antecedendo a OSH. No momento pós-OSH observou-se 0,18 - 16,2% (2,77±3,67%) de hemácias marcadas para anticorpos anti-IgG FITC e 0,15 - 19,8% (4,01±4,46%) para anticorpos anti-IgM FITC. O percentual de hemácias marcadas com anticorpos anti-IgG FITC diferiu entre os grupos controle e piometra, pré-OSH (p<0,001) e pós-OSH (p<0,001). Em relação a anticorpos anti-IgM FITC, não foram observadas diferenças entre os grupos controle e pré-OSH (p=0,09), porém, após a OSH houve aumento na marcação de hemácias, quando comparado ao grupo controle (p<0,001). Apenas alguns animais apresentaram mais de 5% de hemácias marcadas, e isto ocorreu, principalmente, no momento pós-OSH. Entretanto, não resultou no agravamento da anemia, indicando que a piometra em cadelas está associada à deposição de imunoglobulinas G ou M na superfície das hemácias, sem, no entanto, promover hemólise ou agravamento da anemia

Avaliação de microtécnicas de extração para análise de lamotrigina em plasma de pacientes epilépticos por eletroforese capilar

A lamotrigina (LTG) é um fármaco pertencente à classe das feniltriazinas utilizado no tratamento de crises epilépticas generalizadas e focais e no tratamento adjunto da epilepsia refratária. Devido à alta variabilidade interindividual, às interações medicamentosas e aos efeitos adversos apresentados durante a administração da LTG, a monitorização terapêutica nos pacientes que fazem uso deste fármaco é necessária para ajuste de dose individual e evitar os efeitos adversos. Assim, o objetivo deste trabalho foi a avaliação de duas técnicas de microextração: a microextração em fase líquida com fibras ocas (HF-LPME) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) para análise da lamotrigina em amostras de plasma de pacientes epilépticos. Primeiramente foram definidas as condições eletroforéticas: foi utilizado um capilar de sílica fundida de 75 ?m de diâmetro interno e 50 cm de comprimento efetivo. O eletrólito de corrida (BGE) foi composto por ácido 2-morfolinoetanosulfônico (MES), na concentração de 130 mmol L-1 e pH 5,0. As análises foram realizadas à temperatura de 20°C e tensão de 15 kV. A amostra foi injetada hidrodinamicamente (0,5 psi por 10 s) e a detecção foi feita em 214 nm. Nestas condições a LTG e o padrão interno (PI), lidocaína, puderam ser analisados em menos de 7 minutos. A HF-LPME foi avaliada no modo de 3 fases, usando 500 ?L de plasma e 3,5 mL de solução fosfato de sódio 50 mmol L-1 pH 9,0 como fase doadora. O solvente utilizado para impregnar a fibra foi o 1-octanol. Como fase aceptora foram utilizados 60 ?L de solução de ácido clorídrico pH 4,0. Para avaliação da DLLME, foi necessária uma etapa de pré-tratamento da amostra (500 ?L de plasma) com 1 mL de acetonitrila. Após isto, 1,3 mL do sobrenadante foram adicionados a 4 mL de solução fosfato de sódio 50 mmol L-1 pH 9,0 e 120 ?L de clorofórmio (solvente extrator) foram injetados nesta amostra aquosa e 165 ?L de fase sedimentada foram recuperados. As características de desempenho analítico para ambos os métodos foram avaliadas, sendo obtida linearidade na faixa de concentração plasmática de 1-20 ?g/mL e limite inferior de quantificação (LIQ) de 1 ?g mL-1. Os ensaios de precisão e exatidão apresentaram valores de acordo com os guias oficiais. Além disso, os métodos foram seletivos, não apresentaram efeito residual e as amostras foram estáveis. Os valores de recuperação foram de 54,3 e 23% para HF-LPME e DLLME, respectivamente. Os métodos validados foram aplicados com sucesso em amostras de plasma de pacientes epilépticos em tratamento com a LTG. Além disso, as duas técnicas foram comparadas e a HF-LPME apresentou vantagens em relação à DLLME, mostrando ser uma técnica promissora para análise de matrizes complexas, com reduzido consumo de solvente orgânico e possibilidade de automação.

Investigação da atividade apoptótica na abertura luminal dos ductos das glândulas salivares: análise comparativa entre modelo animal e humano

As glândulas salivares são estruturas essenciais para a manutenção da homeostase da cavidade oral pela síntese e secreção do fluido salivar. A disfunção ou perda permanente das glândulas salivares causadas por radioterapia, doenças inflamatórias ou desordens congênitas elevam principalmente o risco de infecções da mucosa oral e de estruturas dentárias, além de potencialmente prejudicar funções fisiológicas como fala, mastigação e paladar, diretamente interferindo na qualidade de vida dos indivíduos afetados. Os tratamentos atualmente disponíveis são apenas paliativos, ressaltando a necessidade de se compreender melhor os processos embriogênicos a fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas capazes de regenerar as glândulas salivares. O princípio da formação das glândulas salivares baseia-se na coordenação de diversos processos morfogenéticos, e este trabalho foca particularmente em investigar a formação do espaço luminal do sistema de ductos, uma vez que a adequada abertura dos lumens é um processo essencial para a secreção salivar. Relata-se que a remoção das células centrais dos cordões sólidos epiteliais por morte celular apoptótica é o principal mecanismo de abertura do espaço luminal dos futuros ductos glandulares em camundongos. Porém, pouco se sabe sobre o controle temporal da apoptose durante o desenvolvimento glandular e sobre seu comportamento em glândulas salivares humanas. Neste trabalho, o perfil de expressão de diversas proteínas envolvidas na cascata apoptótica em glândulas salivares fetais humanas foi analisado de acordo com cada estágio morfogenético por imunoistoquímica (Bax, Bak, Bad, Bid, Bcl-2, Bcl-x, Bcl-xL, caspase-3 clivada, caspases-6, -7 e -9, apaf-1, survivina e citocromo c). As análises semi-qualitativas resultaram em negatividade apenas para as proteínas Bcl-2, Bad, Bid e caspase-3 clivada em todas as fases de desenvolvimento. A expressão nuclear de Bax e Bak foi identificada em presumidos espaços luminais em estágios precoces, enquanto Bcl-xL foi o fator antiapoptótico da família Bcl-2 que exibiu expressão nuclear mais importante. Caspases-6, -7 e -9 foram positivas em todas as fases, e a ausência de caspase-3 clivada sugere caspase-7 como principal caspase efetora da apoptose em desenvolvimento de glândulas salivares humanas. Ambos os componentes do complexo apoptossomo foram positivos durante o desenvolvimento glandular, e o inibidor survivina demonstrou mais positividade nuclear em estágios mais avançados. Ao observar a expressão de reguladores apoptóticos durante o desenvolvimento glandular humano, foram realizados experimentos funcionais com culturas de tecido glandular de camundongos para avaliar o papel das caspases durante a formação desta estrutura. Inicialmente detectou-se a atividade apoptótica em glândulas salivares de camundongos albinos no centro dos cordões epiteliais primários a partir de estágios precoces de desenvolvimento através de TUNEL e caspase-3 clivada. A partir disso, foi realizada a inibição apoptótica funcional in vitro durante o mesmo período, que resultou em ductos significativamente mais amplos e em defeitos morfológicos importantes nas estruturas luminal e acinar. Este trabalho evidenciou portanto atividade apoptótica durante a formação de glândulas salivares humanas e de camundongo, expressando-se em fases mais precoces do que reportadas anteriormente. Além disso, a ausência de Bad e Bid indica que a via intrínseca está mais ativa que a extrínseca, e distintos perfis de expressão da maioria das moléculas sugere adicionais funções não-apoptóticas durante a morfogênese glandular.