Estudo da cinética da tirosinase imobilizada em nanopartícula de sílica com obtenção de revestimento de eumelanina

Melanina é um polímero constituído por uma grande heterogeneidade de monômeros tendo como característica comum a presença de grupos indóis. Por outro lado, a eumelanina produzida pela oxidação enzimática da tirosina é um polímero mais simples constituído principalmente de monômeros 5,6-dihidroxindol (DHI) e de indol-5,6-quinona (IQ). Tirosinase é a enzima chave na produção de melanina, sendo que a sua atividade cinética é medida em função da formação do intermediário dopacroma. Nanopartículas (NPs) de sílica são partículas nanométricas compostas de oxido de silício e são obtidas pelo processo sol-gel desenvolvido por Stöber de hidrólise e condensação de tetraetilortosilicato (TEOS), usando etanol como solvente em meio alcalino. As NPs foram funcionalizadas com 3-Aminopropiltrietoxissilano (ATPES) e depois com glutaraldeído. Este último permitiu a imobilização da tirosinase na superfície da sílica. Caracterizamos as NPs antes e após a reação da enzima, a atividade catalítica da enzima ligada à NP e o mecanismos de formação de melanina na superfície da sílica. As NPs foram caracterizadas por espectrofotometria de absorção e de reflectância, termogravimetria e microscopia eletrônica. A síntese da NP de sílica retornou partículas esféricas com 55nm de diâmetro e a funcionalização da partícula mostrou modificar eficientemente a sua superfície. A imobilização da tirosinase por ligação covalente foi de 99,5% contra 0,5% da adsorção física. A atividade da tirosinase foi caracterizada pela formação de dopacroma. O Km da enzima imobilizada não sofreu alteração em comparação com a tirosinase livre, mas a eficiência catalítica - que considera a eficiência recuperada - foi de apenas 1/3 para a enzima ligada covalentemente, significando que 2/3 das enzimas ligadas não estão ativas. Obtivemos NPs revestidas com melanina a partir de oxidação de tirosina solubilizada em duas preparações: NP com tirosinase ligada covalentemente na superfície e NP funcionalizada com glutaraldeido dispersa em solução de DHI e IQ. O revestimento de melanina foi na forma de um filme fino com espessura ~1,9nm, conferindo perfil de absorção luminosa equivalente ao da própria melanina. Mostramos que o mecanismo de polimerização passa pela oxidação da tirosina pela tirosinase, que gera intermediários oxidados (principalmente DHI e IQ) que vão para solução (mesmo quando a tirosinase está ligada covalentemente na sílica). Estes intermediários ligam-se ao glutaraldeido e a superfície da sílica passa a funcionar como ambiente de polimerização da melanina.

Expressão de metaloproteinases de matriz (MMPS) e de seus inibidores (TIMPS e RECK) em modelo de progressão tumoral de Câncer de mama e sua correlação com dados clínicos-patológicos

O câncer de mama é o tipo de câncer mais comumente detectado em mulheres de todo o mundo. Na maioria das pacientes, a causa de morte se deve, principalmente, à doença metastática que pode se desenvolver a partir do tumor primário. O processo metastático envolve uma complexa cascata de eventos, incluindo a quebra organizada dos componentes da matriz extracelular por metaloproteinases de matriz (MMPs). A atividade das MMPs é precisamente regulada por inibidores específicos, os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs). Dado seu papel na progressão tumoral, níveis elevados de MMPs têm sido associados com prognóstico desfavorável para pacientes com câncer. Por outro lado, sendo os TIMPs proteínas multifuncionais, níveis elevados de TlMP-1 e de TIMP-2 correlacionam com agressividade do tumor e prognóstico ruim em diferentes tipos de câncer, incluindo o câncer de mama. O gene supressor de metástase RECK codifica uma glicoproteína de membrana capaz de inibir a invasão e a metástase tumoral através da regulação negativa da atividade de MMPs envolvidas em carcinogênese: MMP-2, MMP-9 e MMP-14 (MT1-MMP). A fim de analisar o papel das MMPs e de seus inibidores (TIMPs e RECK) na progressão tumoral do câncer de mama, o perfil de expressão destes genes foi detectado, através de ensaios de Real-Time PCR, em um painel de cinco linhagens celulares de carcinoma de mama humano com diferentes potenciais invasivos e metastáticos e em 72 amostras teciduais de tumores primários de mama e 30 amostras teciduais de borda normal adjacente ao tumor. O perfil de expressão protéica de RECK foi avaliado em 236 amostras de tumores primários de mama através de ensaios de Tissue Microarray. Além disso, a atividade proteolítica das MMPs foi detectada em ensaios de Zimografia. Os resultados obtidos indicam que a progressão do câncer de mama humano está relacionada com um aumento dos níveis de expressão das MMPs e de seus inibidores específicos. O aumento dos níveis de expressão dos TIMPs parece estar relacionado ao seu papel como proteína multifuncional que pode estar funcionando de maneira a promover, mais do que suprimir, a progressão tumoral. Níveis elevados da expressão protéica de RECK estão associados com pior prognóstico. No entanto, para pacientes em estádios clínicos avançados, altos níveis de expressão de RECK podem estar correlacionados com melhor prognóstico, dependendo do balanço MMP/inibidor. Os níveis de expressão das MMPs apresentaram correlação positiva em relação aos níveis de expressão de seus inibidores específicos, sugerindo a existência de fatores e vias de sinalização comuns envolvidas na regulação coordenada destes genes. Além disso, a síntese do inibidor pode estar relacionada a uma resposta celular ao aumento da expressão e atividade de proteases. O balanço transcricional enzima/inibidor favorece a enzima nas amostras tumorais e, de modo contrário, o inibidor específico nas amostras de borda normal, sugerindo o balanço como o principal fator na determinação da degradação da MEC em processos invasivos e metastáticos. Os resultados obtidos podem contribuir para um melhor entendimento da complexidade dos mecanismos envolvidos na metástase do câncer de mama.

Disponibilidade de níquel no sistema solo-planta: efeito de doses e saturações por bases

Por se tratar de um elemento essencial às plantas e um metal pesado ao mesmo tempo, o níquel requer atenção quanto aos aspectos da fisiologia de plantas e ambiental. Além disso, existe um intervalo estreito entre as exigências nutricionais e os teores tóxicos às plantas. Neste contexto, objetivou-se avaliar o efeito do Ni no sistema solo-planta, com foco no ciclo do N e a disponibilidade do elemento no solo, por meio de experimento em condições controladas, utilizando vasos distribuídos inteiramente ao acaso, utilizando-se esquema fatorial 2 x 5, com sete repetições cada tratamento. O primeiro fator foi constituído de duas saturações por base (50 e 70%) e o segundo de cinco doses de Ni (0; 0,1; 0,5; 1,0 e 10,0 mg dm-3 de solo). Os vasos foram preenchidos com 8 dm3 de terra e cultivados com soja [Glycine max (L.) Merrill] sucedida por girassol (Helianthus annuus L.). Os parâmetros qualitativos e quantitativos: altura de plantas (AP), diâmetro do caule (DC), número de nós (NN), estádio fenológico (EF), índice SPAD e, diâmetro do capítulo (DCap) (para girassol) foram avaliadas aos 30 e 60 dias após a emergência (d.a.e.) de cada cultivo. Plantas inteiras de soja, amostradas em quatro vasos de cada tratamento, foram coletadas no estádio R1. Na mesma ocasião foram coletadas amostras de solo da rizosfera. Em seguida, as plantas coletadas foram divididas em: folhas; raízes (nódulos na soja) e parte aérea. Foram determinados nas folhas utilizadas para diagnose em soja e girassol: os teores de macro e micronutrientes, as atividades da redutase do nitrato e da urease e as concentrações dos ácidos orgânicos: oxálico, malônico, succínico, málico, tartárico, fumárico, oxaloacético, cítrico e lático. Os mesmos ácidos orgânicos foram determinados em raízes secundárias de girassol e nódulos de soja. Foram realizadas avaliações ultraestruturais por meio de microscopia eletrônica de transmissão (MET) em raízes de girassol, e estruturais e de tonalidade em nódulos de soja, por meio de microscopia de luz. No solo, foram determinadas: atividade urease, desidrogenase, Ni total e fitodisponível pelos métodos: Mehlich-1, Mehlich-3 e DTPA. No período de maturidade fisiológica de cada cultura foi realizada a colheita das plantas dos vasos restantes para determinação de produção de grãos, teores de Ni na planta inteira e Ni e N nos grãos. Ao final dos dois experimentos foi realizada nova coleta de solo para extração sequencial de Ni. O índice SPAD em soja aos 60 d.a.e., a produção de massa seca da parte aérea da soja e da raiz de girassol foram influenciados pela saturação por bases, doses de níquel e pela a interação destes. Foram influenciados pelas saturações por base e doses de níquel (fatores isolados): para soja: AP aos 60 d.a.e., NN aos 30 e 60 d.a.e., SPAD aos 30 d.a.e.; para girassol: AP e NN aos 30 e 60 d.a.e., DC e SPAD aos 30 d.a.e. As demais variáveis avaliadas aos 30 e 60 d.a.e. foram influenciadas apenas pela saturação por bases, ou doses de Ni separadamente. As plantas de soja e girassol apresentaram maiores teores de Ni nos diferentes tecidos avaliados (exceto grãos) quando cultivadas sob V50%. A produção de grãos de soja e girassol não foi influenciada pelos tratamentos, porém o teor de N dos grãos de soja influenciado pelas doses de Ni na V70%. A atividade da enzima urease nas folhas de soja e girassol foi responsiva positivamente ao aumento das doses de Ni. Quatro dos ácidos orgânicos avaliados e o teor de N nas folhas e nos grãos foram maiores nas plantas cultivadas sob V70% com a dose de 0,5 mg dm-3 de Ni. As doses de Ni bem com as saturações por bases influenciaram diretamente o balanço de nutrientes das plantas. Os extratores Mehlich-1, Mehlich-3 e DTPA apresentaram elevado coefienciente de correlação entre a fração de Ni disponível no solo e a concentração do elemento nas plantas de soja e girassol, sendo o extrator DTPA o que apresentou maior coeficiente de correlação. O Ni apresentou distribuição variável entre as diferentes frações do solo em função dos tratamentos. Os solos dos tratamentos com saturação por bases de 70% apresentaram maior concentração de Ni ligado a carbonato, comparado aos tratamentos sob saturação por bases de 50%. A distribuição do Ni entre as frações do solo seguiu a seguinte orgem: ligado a carbonato < trocável < ligado a óxidos < matéria orgânica < residual. A saturação por bases exerceu efeito diferenciado para a atividade da urease no solo em função da cultura avaliada. Por sua vez, o Ni exerceu efeito diferenciado sobre a atividade de desidrogenase em função da cultura estudada