Interactions of maize bushy stunt phytoplasma with the leafhopper vector, Dalbulus maidis (Delong and Wolcott) (Hemiptera: Cicadellidae) and associated microbiota

Phytoplasmas are bacteria with a persistent propagative transmission by insect vectors that generates direct and indirect interactions among them. In order to understand these interactions for maize bushy stunt phytoplasma (MBSP) and the leafhopper vector Dalbulus maidis (Hemiptera: Cicadellidae), two research lines were addressed. The first one aimed to determine the indirect effects of maize infection by MBSP on some biological and behavioral parameters of the vector, whereas a second line investigated direct interactions of the phytoplasma with D. maidis during its movement through the vector body following acquisition from plants, and associated microbiota. Indirect effects were investigated in choice experiments in which alighting and oviposition preferences by D. maidis were compared on healthy vs. MBSP-infected plants with variable incubation time (diseased plants with early and advanced symptoms, or still asymptomatic). Likewise, indirect effect of MBSP on the D. maidis biology was determined in two life table experiments in which the vector was reared on healthy vs. MBSP-infected plants expressing advanced disease symptoms or still asymptomatic. Choice experiments showed that alighting and oviposition preferences of D. maidis on MBSP-infected plants compared to healthy plants depend on the pathogen incubation period in the plant. The leafhopper preferred MBSP-infected plants over healthy ones during the asymptomatic phase of the disease, but rejected infected plants with advanced symptoms. The vector was able to acquire MBSP from asymptomatic infected plants shortly (3 days) after inoculation, but transmission efficiency increased when acquisition occurred at later stages of the pathogen incubation period (≥14 days) in the source plants and the test plants showed disease symptoms faster. These results suggest that MBSP modulates D. maidis preference for asymptomatic infected plants in the early stages of the crop, allowing rapid spread of this pathogen. Maize infection by the phytoplasma had a neutral effect on most life table parameters of D. maidis; a lower net reproductivity rate (Ro) was observed in the cohort reared on MBSP-infected plants with advanced symptoms, which was compensated to some extent by a higher sexual ratio. MBSP acquisition by all vector nymphal stadia was confirmed by PCR, and the pathogen as detected in both male and female reproductive organs. Concerning direct MBSP-vector interactions, transmission electron microscopy analyses showed phytoplasma-like cells in the midgut lumen, microvilli and epithelial cells, suggesting that MBSP enters the epithelium midgut through the microvilli wall. Within the epithelial cells, mitochondria and bacteria-like cells (possibly endosymbionts) were observed together with masses of phythoplasma-like cells. In the hemocoel, phytoplasma-like cells grouped into a matrix were also observed in association with bacteria-like cells similar to those observed in the midgut epithelium. Similar associations were found in the salivary gland. Interestingly, in-situ hybridization (FISH) technique revealed a variation in diversity and abundance of the microbiota in intestine and salivary glands of D. maidis adults over time after MBSP acquisition from plants. Sulcia sp., Cardinium sp. and eubacteria increased their abundance over time, whereas Rickettsia sp. decreased. The frequent association of the vector microbiota with the phytoplasma in some tissues of D. maidis suggests that endosymbiotic bacteria may play some role in MBSP-vector interactions.

Caracterização anatomopatológica, microbiológica e parasitológica de ratos Wistar (Rattus norvegicus) em diferentes idades

Os ratos Wistar são amplamente empregados como modelo animal na pesquisa biomédica e o controle sanitário dos biotérios é essencial para garantir a qualidade dos experimentos. O objetivo do estudo foi a caracterização do estado sanitário da colônia de ratos Wistar em sistema de criação convencional e para tanto determinar as bactérias, fungos, virus e parasitos, bem como caracterizar as lesões anatomopatológicas do sistema respiratório. Foram utilizados 273 ratos (N), machos (M) e fêmeas (F), das faixas etárias 4, 8, 12, 16 a 20 semanas e entre 12 a 18 meses, para as determinações de peso e condição corpórea (N=273, 140M, 133F); avaliação bacteriológica de orofaringe, mucosa intestinal e lavado traqueobrônquico (N=40, 20M, 20F); determinação de anticorpos para vírus e bactérias (N=20, 10M, 10F); exame parasitológico (N=60, 30M, 30F); identificação molecular de Mycoplasma pulmonis em amostras de pulmão (N=25, 15M, 10F), e caracterização anatomopatológica da cavidade nasal, orofaringe, laringe, traqueia e pulmão (N=106, 53M, 53F). Foram realizadas ainda avaliações microbiológicas das salas dos ratos em três períodos com isolamento de Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Bacillus spp., Aspergillus spp. e Penicillium spp. O peso se mostrou homogêneo dentro da faixa etária e gênero, com apenas sete animais magros (2,56%) e nove em sobrepeso (3,30%). Não foram isoladas bactérias patogênicas na orofaringe, mucosa intestinal e lavado traqueobrônquico por cultivo. Mycoplasma pulmonis foi determinado em 72% das amostras pulmonares e em 100% dos soros testados. Em 35% foram detectados anticorpos para Reovirus tipo III e em 100% para bacilos associados ao epitélio respiratório ciliado. Syphacia muris foi diagnosticada em 91,67%, Eimeria spp. em 3,33% e Entamoeba muris em 1,67%. Lesões relacionadas a infecção por agentes exógenos foram observadas em cavidade nasal e na orofaringe, laringe e traqueia a partir da 4 semanas de idade e, em pulmão desde as 12 semanas, com aumento de frequência de ocorrência e do grau de progressão, com o avançar da idade, nos vários segmentos estudados. Concluímos que a caracterização do estado sanitário dos ratos permite conhecer as particularidades do modelo biológico utilizado e compor base de dados para auxiliar no desenho e na interpretação experimental dos pesquisadores, além de garantir uma base para o programa de monitorização sanitária de biotérios em condições similares

Avaliação da contaminação conjunta de Dekkera bruxellensis e Lactobacillus fermentum sobre a fermentação alcoólica: efeito do substrato e formas de controle

As contaminações por leveduras selvagens e por bactérias no processo de produção de etanol combustível no Brasil causam prejuízos ao rendimento fermentativo e aumento de custos pelo uso de biocidas. No entanto, poucos estudos tem focado no efeito das contaminações conjuntas de leveduras selvagens e bactérias e as possíveis interações entre os micro-organismos, especialmente em função dos diferentes substratos de fermentação e das formas de controle. Este trabalho teve por objetivos verificar o efeito do substrato (caldo de cana e melaço) sobre o desenvolvimento das contaminações pela levedura da espécie Dekkera bruxellensis e pela bactéria Lactobacillus fermentum, em co-culturas com Saccharomyces cerevisiae (linhagem industrial PE-2) e possíveis formas de controle do crescimento dos contaminantes (pelo uso de metabissulfito de potássio e adição de etanol ao tratamento ácido) sem afetar a levedura do processo. Os testes foram realizados em condições de crescimento (substrato com 4 °Brix, culturas agitadas) e fermentação com reciclo celular (substrato com 16 °Brix, culturas estáticas). Houve interação entre as leveduras e a bactéria quando crescidas em caldo de cana 4 °Brix. A levedura industrial não foi afetada pela presença dos micro-organismos contaminantes, no entanto, para D. bruxellensis a presença de L. fermentum interferiu positivamente no crescimento, com aumento no número de UFC, e consequentemente inibição do crescimento da bactéria. Em melaço, houve um estímulo ao crescimento de L. fermentum quando em co-cultura com S. cerevisiae. Houve influência das contaminações sobre os parâmetros avaliados no experimento (pH, açúcar redutor total, etanol, glicerol e crescimento das células) e a contaminação conjunta de L. fermentum e D. bruxellensis potencializou o efeito das contaminações pelos micro-organismos isoladamente, tanto em caldo quanto em melaço. A adição de 13% de etanol à solução de ácido sulfúrico pH 2,0 no tratamento celular resultou em uma diminuição significativa no número de UFC de D. bruxellensis (entre 90-99%). A levedura PE-2 foi pouco afetada pelo tratamento proposto. A bactéria L. fermentum teve seu crescimento afetado em todas as combinações testadas. Como os experimentos foram feitos em co-culturas, verificouse que pode haver influência de um micro-organismo sobre a viabilidade do outro, dependendo da reação ao tratamento ácido-etanol. O metabissulfito de potássio (MBP), no intervalo entre 200-400 mg/L, foi eficaz para controlar o crescimento de D. bruxellensis dependendo do meio de cultura e linhagem. Quando adicionado (250 mg/L) à solução ácida (pH 2,0) no tratamento celular, um efeito significativo foi observado nas culturas mistas, pois ocorreu a inativação do SO2 pela S. cerevisiae e uma provável proteção das células de D. bruxellensis, não sendo essa levedura prejudicada pelo MBP. A resposta fisiológica de S. cerevisiae na presença de MBP pode explicar a diminuição significativa na produção de etanol. Quando o MBP foi adicionado ao meio de fermentação, resultou no controle da D. bruxellensis mas não em sua morte, com efeito menos intensivo sobre a eficiência fermentativa. Em cocultura com a adição de MBP, a eficiência fermentativa foi significativamente menor do que na ausência de MBP.

Efeito do substrato e das condições de tratamento do fermento sobre a fermentação etanólica contaminada com leveduras Saccharomyces cerevisiae selvagens e Lactobacillus fermentum

Pouco se sabe sobre o efeito do substrato e a interação entre as leveduras selvagens e bactérias do gênero Lactobacillus na fermentação alcoólica, pois os estudos tem se concentrado na avaliação dos efeitos da contaminação por um ou outro contaminante separadamente. Diante disso, este trabalho teve como objetivos estudar o efeito do substrato e das condições de tratamento do fermento sobre as fermentações contaminadas com ambos os micro-organismos, leveduras S. cerevisiae selvagens (três linhagens apresentando colônias rugosas e células dispostas em pseudohifas) e Lactobacillus fermentum, tendo a linhagem industrial de S. cerevisiae PE-2 como levedura do processo. Foram realizadas fermentações em batelada em mosto de caldo e de melaço, sem reciclo e com reciclo celular, utilizando tanto a cultura pura da linhagem PE-2 quanto as culturas mistas com as linhagens rugosas e ou L. fermentum. Foram avaliadas modificações no tratamento ácido do fermento, visando o controle do crescimento dos contaminantes sem afetar a levedura do processo. Em seguida, foram conduzidas fermentações contaminadas e não contaminadas submetidas ao tratamento ácido combinado com adição de etanol, tanto em caldo quanto em melaço, utilizando-se PE-2, uma das linhagens rugosas e L. fermentum. A atividade da invertase extracelular foi também avaliada em ambos os substratos para os micro-organismos estudados, em condições de crescimento. Concluiu-se que o tipo de substrato de fermentação, caldo de cana ou melaço, influenciou o desempenho da linhagem industrial PE-2 assim como afetou o desenvolvimento das contaminações com as leveduras rugosas S. cerevisiae na presença ou ausência da bactéria L. fermentum, em fermentações sem reciclo celular. O efeito da contaminação foi mais evidente quando se utilizou caldo de cana do que melaço como substrato, no caso da contaminação com leveduras rugosas, e o inverso no caso da contaminação com L. fermentum. O efeito da contaminação sobre a eficiência fermentativa foi maior na presença da levedura rugosa do que com a bactéria, e a contaminação dupla (tanto com a levedura rugosa quanto com a bactéria) não teve efeito maior sobre a eficiência fermentativa do que a contaminação simples, por um ou por outro micro-organismo isoladamente, especialmente na fermentação em batelada com reciclo celular, independentemente do substrato. Nas fermentações com reciclo de células, o efeito do substrato foi menos evidente. O controle do crescimento das linhagens rugosas pode ser realizado modificando o tratamento ácido normalmente realizado na indústria, seja pela adição de etanol à solução ácida ou pelo abaixamento do pH, dependendo da linhagem rugosa. O tratamento combinado baixo pH (2,0) + 13% etanol afetou a fisiologia da linhagem industrial, trazendo prejuízos à fermentação com reciclo celular, com pequeno controle sobre o crescimento da levedura rugosa e causando morte celular à L. fermentum. A diferença na atividade invertásica entre as linhagens rugosas e industrial de S. cerevisiae pode ser a responsável pela fermentação lenta apresentada pelas linhagens rugosas quando presentes na fermentação, sendo não significativa a influência do substrato sobre a atividade dessa enzima.

Estudo da viabilidade para introduzir na rotina testes de diagnóstico para infecção respiratória aguda

Para avaliar os benefícios da comunicação rápida ao clínico do diagnóstico de vírus respiratórios, foi analisado a viabilidade econômica de 2 testes, com o tempo de entrega de resultado em 2 horas para teste rápido e 48 horas para Biologia Molecular. As amostras coletadas foram processadas utilizando técnicas convencionais e os testes disponíveis no mercado local. Foram escolhidos dois testes rápidos pelo método de imunocromatografia para quatro parâmetros analíticos: Influenza A, Influenza H1N1, Influenza B e Vírus Sincicial Respiratório (RSV) e em Biologia Molecular um teste de RT-PCR multiplex com 25 patógenos entre vírus e bactérias. O tipo de amostra utilizada foi swab e lavado de nasofaringe. A população escolhida para o estudo foi paciente adulto, em tratamento de câncer, que necessita de uma resposta rápida já que a maioria se encontra com comprometimento do sistema imune por doença ou por tratamento. O estudo foi transversal, realizado entre os anos de 2012 e 2013, para avaliar a viabilidade econômica da introdução de testes de diagnóstico da infecção respiratória aguda de etiologia viral a partir de amostras de nasofaringe em pacientes com câncer atendidos no Centro de Atendimento de Oncologia Intercorrência (CAIO ), do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP), hospital público que atende exclusivamente Sistema Único de Saúde (SUS) e Hospital A.C. Camargo, que atende tanto a pacientes do SUS como da rede privada. O estudo incluiu 152 pacientes em tratamento para qualquer tipo de câncer, predominantemente do sexo feminino (81 mulheres e 70 homens) com idades entre 18-86 anos. Para participar do estudo o paciente era consultado e o critério para escolha do paciente foi ser portador de câncer, com história de febre (ainda que referida) acompanhada de tosse ou dor de garganta, tosse e sintomas respiratórios agudos, atendidos por protocolo padronizado que inclui avaliação na admissão, seguimento e manejo antimicrobiano. Para a avaliação econômica os pacientes foram classificados de acordo com o estado geral de saúde, se apresentavam bom estado de estado de saúde poderiam receber alta e faziam uso da medicação em casa evitando 5 dias de internação se recebessem algum resultado para Influenza ou RSV, no entanto os pacientes que apresentavam outro vírus, resultado negativo ou o estado geral era ruim permaneciam internados por 7 dias em observação e cuidados com medicação adequada. Foram realizadas análises econômicas em dois âmbitos: o sistema de saúde publico e o privado considerando o fator diminuição de dias de internação. A analise de Custo-benefício foi eficiente no Sistema privado mas inadequada para o SUS assim como, qualquer outra medida monetária já que os valores de reembolso do SUS estão defasados do custo de qualquer internação. A análise de Custo-efetividade que olha para outros fatores além do monetário foi efetiva nos dois sistemas que enfrentam falta de leitos além da condição de saúde do paciente de evitar a ingestão desnecessária de antibióticos, evitar os gastos do acompanhante, perda de dias de trabalho e estudo. Não houve correspondência de resultados dos testes rápidos com o multiplex de Biologia Molecular

Monitoramento da interação entre rizobactéria RZ2MS16 (Burkholderia ambifaria) promotora de crescimento e bioinoculantes comerciais aplicados nas culturas de soja e milho

As culturas da soja e milho são de grande importância econômica mundial e também para o Brasil, onde a área cultivada com essas duas culturas está estimada em 45.855.900 mil hectares, distribuídas em todos estados produtores conforme suas características. A estimativa da safra mundial de soja em 2015/16 apresentou uma redução na produção global da oleaginosa para 319,0 milhões de ton, volume 1,1 milhão de ton inferior ao levantamento de dezembro de 2015. Ainda assim, trata-se de um volume recorde. Para o milho, a produção global foi de 967,9 milhões de ton, com uma redução no volume de 5,9 milhões de ton em relação ao levantamento realizado em dezembro de 2015. Nessas duas culturas são comumente utilizadas bactérias fixadoras de nitrogênio (BFN), reduzindo ou até mesmo, eliminando a aplicação de adubos nitrogenados. Estudos apontam que a simbiose entre BFN e as culturas soja e milho pode ser otimizada mediante a coinoculação com rizobatérias promotoras de crescimento de plantas (RPCP). Apesar de promissora, o estudo da utilização de BFN em associação com RPCPs é incipiente no Brasil. Assim, o presente trabalho teve como objetivo monitorar, a partir da marcação bacteriana, a interação entre a linhagem de Burkholderia ambifaria (RZ2MS16), uma rizobactéria proveniente do guaranazeiro e previamente descrita como promotora de crescimento em soja e milho e linhagens das espécies Bradyrhizobium japonicum (SEMIA5079), Bradyrhizobium diazoefficiens (SEMIA5080) e Azospirillum brasilense (Ab-v5 e Ab-v6) que são comercialmente utilizadas como bioinoculantes nessas culturas respectivamente. Os efeitos sinergisticos da interação entre RZ2MS16 e bioinoculantes comercias foram avaliados em experimento de casa de vegetação. Também foi avaliado o efeito da coinoculação de bioinculantes com outra rizobactéria proveniente do guaranazeiro, Bacillus sp. (RZ2MS9). As linhagens foram inoculadas separadamente e coinoculadas, sendo melhores resultados observados com a coinoculação das linhagens. As linhagens marcadas com genes de fluorescência selecionadas para estudo de interação foram RZ2MS16, Ab-v5 e SEMIA5080, sendo essa interação observada por microscopia de fluorescência, com também pelo reisolamento das linhagens marcadas. As linhagens RZ2MS16:pNKGFP e Ab-v5: pWM1013 e SEMIA5080:pWM1013 colonizaram todos os nichos avaliados em milho e soja, respectivamente, sendo também caracterizadas como endofíticos. Assim se observa que estudos desta natureza são de grande importância para um melhor entendimento da interação entre bactéria planta e o efeito da coinoculação no melhor desenvolvimento de plantas comercialmente utilizadas.