Efeitos da glutamina e taurina sobre a via de sinalização do NFκB em células Raw 264.7 estimuladas com LPS

O sistema imunológico preserva a integridade do organismo perante o ambiente que ele está inserido. As reações imunológicas são essenciais para controle e eliminação da infecção, no entanto se os mecanismos contra regulatórios da resposta imunológica forem superados, a homeostasia pode falhar levando a um desequilíbrio no processo de reparo do organismo, podendo causar danos, insuficiência de órgão e até a morte. Muitos estudos têm demonstrado a interação entre o sistema imunológico e os aminoácidos. Visto que a glutamina é utilizada como substrato energético para enterócitos, além de fornecer nitrogênio para síntese de purinas e pirimidinas para proliferação celular e a taurina participa da hemostasia, estabilização de membranas, mobilização de cálcio, além de ser importante agente antioxidante, nos propusemos nesse trabalho investigar os efeitos da glutamina e taurina sobre aspectos relacionados a resposta imunológica de células da linhagem Raw 264.7. Para tanto foram avaliadas: viabilidade celular; a capacidade proliferativa e o ciclo celular; a capacidade de síntese de citocinas: IL-1 α, IL-1β, IL-6, IL-10 e TNF-α e a expressão do fator de transcrição NFκB, bem como de seu inibidor IκBα. Foi possível observar aumento da viabilidade e proliferação celular para células tratadas com glutamina, entretanto não foi observado o mesmo efeito para taurina. Quando ambos aminoácidos foram associados, houve prevalência dos efeitos da glutamina. Observamos neste trabalho, que houve uma tendência da diminuição de expressão da relação de p-NFκB/NFκB quando se aumentou a concentração de glutamina. Paralelamente, o mesmo foi encontrado para relação p-IκB/IκB. Esses resultados corroboram com os resultados encontrados na produção das citocinas pró-inflamatórias IL-1α, Il-1β e TNF-α, uma vez que ao aumentarmos a concentração de glutamina bem como glutamina e taurina, observamos menor produção das mesmas. Complementarmente, encontramos resultados opostos para a citocina anti-inflamatória IL-10, a qual teve maior síntese em resposta ao aumento da concentração dos aminoácidos. Portanto concluímos que tanto a glutamina quanto a taurina possuem capacidade de modular aspectos da resposta imunológica de células Raw 264.7.

Análise funcional das proteínas HrcA, GroES/GroEL e DnaK/DnaJ em Caulobacter crescentus

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico σ32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem.