Análise funcional das proteínas HrcA, GroES/GroEL e DnaK/DnaJ em Caulobacter crescentus

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico σ32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem.

Avaliação da influência de aplicação de vibração mecânica na microestrutura e em características mecânicas de juntas do aço inoxidável martensítico CA6NM soldadas pelo processo FCAW

O aço inoxidável martensítico ASTM A743 CA6NM é utilizado para produzir componentes especiais para turbinas hidráulicas, devido às suas boas propriedades mecânicas combinadas com alta resistência à corrosão e cavitação e uma boa soldabilidade. As turbinas hidráulicas são produzidas por meio de múltiplos passes de solda em peças espessas obtidas por fundição. Durante a operação, estes componentes estão sujeitos à erosão por cavitação e trincas em regiões tensionadas, que são reparados também por meio de soldagem. Após o processo de soldagem, um tratamento térmico pós-soldagem é comumente utilizado para aliviar as tensões residuais. Porém, existem dificuldades significativas para a realização de tratamento térmico nas turbinas hidráulicas, tais como a complexidade da geometria de solda, a possibilidade de distorção no caso de quaisquer cargas mecânicas, dificuldade em aquecer simetricamente, e também o tratamento térmico pode causar degradação das propriedades do material. Assim, existe um grande interesse no desenvolvimento de procedimentos de soldagem que elevem a tenacidade ao impacto e evitem o tratamento térmico pós-soldagem. Neste trabalho, a aplicação de vibrações mecânicas durante e após a soldagem para aliviar tensões residuais foram avaliadas em juntas de aço inoxidável martensítico CA6NM soldadas pelo processo Flux Cored Arc Welding (FCAW). A utilização de vibrações mecânicas para reduzir e redistribuir as tensões residuais das estruturas soldadas através da aplicação de carga vibratória pode gerar muitos benefícios. Testes de impacto Charpy (-20 °C), ensaios de tração e dobramento foram realizados conforme ASME IX, e perfis de microdureza nas diferentes regiões da solda foram conduzidos para a caracterização mecânica das juntas soldadas. A caracterização microestrutural foi realizada utilizando difração de raios X, microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados de propriedades mecânicas das amostras vibradas atenderam as exigências especificadas por norma, na qual o processo com tratamento térmico é recomendado para a soldagem deste tipo de aço, visando atingir os níveis de tenacidade do material original. Com relação à microestrutura não foram observados alterações significativas para as amostras vibradas em comparação com a condição \"como soldado\", porém para a condição com tratamento térmico pós-soldagem foi observado uma pequena quantidade de austenita retida, que são precipitadas após o tratamento térmico e permanecem finamente distribuídas após o resfriamento e auxiliam no ganho de tenacidade das juntas soldadas.