Modulação da diferenciação neural de células troco embrionárias por transientes de cálcio intracelulares: papéis dos receptores purinérgicos e de canais de cálcio voltagem-dependentes

Receptores purinérgicos e canais de cálcio voltagem-dependentes estão envolvidos em diversos processos biológicos como na gastrulação, durante o desenvolvimento embrionário, e na diferenciação neural. Quando ativados, canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores purinérgicos do tipo P2, ativados por nucleotídeos, desencadeiam transientes de cálcio intracelulares controlando diversos processos biológicos. Neste trabalho, nós estudamos a participação de canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores do tipo P2 na geração de transientes de cálcio espontâneos e sua regulação na expressão de fatores de transcrição relacionados com a neurogênese utilizando como modelo células tronco (CTE) induzidas à diferenciação em células tronco neurais (NSC) com ácido retinóico. Descrevemos que CTE indiferenciadas podem ter a proliferação acelerada pela ativação de receptores P2X7, enquanto que a expressão e a atividade desse receptor precisam ser inibidas para o progresso da diferenciação em neuroblasto. Além disso, ao longo da diferenciação neural, por análise em tempo real dos níveis de cálcio intracelular livre identificamos 3 padrões de oscilações espontâneas de cálcio (onda, pico e unique), e mostramos que ondas e picos tiveram a frequência e amplitude aumentadas conforme o andamento da diferenciação. Células tratadas com o inibidor do receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), Xestospongin C, apresentaram picos mas não ondas, indicando que ondas dependem exclusivamente de cálcio oriundo do retículo endoplasmático pela ativação de IP3R. NSC de telencéfalo de embrião de camundongos transgênicos ou pré-diferenciadas de CTE tratadas com Bz-ATP, o agonista do receptor P2X7, e com 2SUTP, agonista de P2Y2 e P2Y4, aumentaram a frequência e a amplitude das oscilações espontâneas de cálcio do tipo pico. Dados, obtidos por microscopia de luminescência, da expressão em tempo real de gene repórter luciferase fusionado à Mash1 e Ngn2 revelou que a ativação dos receptores P2Y2/P2Y4 aumentou a expressão estável de Mash1 enquanto que ativação do receptor P2X7 levou ao aumento de Ngn2. Além disso, células na presença do quelante de cálcio extracelular (EGTA) ou do depletor dos estoques intracelulares de cálcio do retículo endoplasmático (thapsigargin) apresentaram redução na expressão de Mash1 e Ngn2, indicando que ambos são regulados pela sinalização de cálcio. A investigação dos canais de cálcio voltagem-dependentes demonstrou que o influxo de cálcio gerado por despolarização da membrana de NSC diferenciadas de CTE é decorrente da ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L. Além disso, esse influxo pode controlar o destino celular por estabilizar expressão de Mash1 e induzir a diferenciação neuronal por fosforilação e translocação do fator de transcrição CREB. Esses dados sugerem que os receptores P2X7, P2Y2, P2Y4 e canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L podem modular as oscilações espontâneas de cálcio durante a diferenciação neural e consequentemente alteram o padrão de expressão de Mash1 e Ngn2 favorecendo a decisão do destino celular neuronal.

Identificação e caracterização de RNA mensageiros candidatos a alvo das proteínas PUMILHO de Arabidopsis através do sistema triplo-híbrido de levedura

Proteínas PUF regulam a estabilidade e a tradução através da ligação a seqüências específicas nas regiões 3\' não traduzidas (3\' UTR) dos mensageiros. A ligação é mediada por um domínio de ligação conservado constituído por 8 repetições de aproximadamente 36 aminoácidos cada. Experimentos realizados no sistema triplo-híbrido de levedura mostraram que os homólogos PUF de Arabidopsis APUM-1, APUM-2 e APUM-3 são capazes de ligar especificamente à seqüência chamada de Elemento de Resposta a NANOS (NRE) reconhecida pelo homólogo PUF de Drosophila. A utilização de bibliotecas de expressão de RNA em ensaios no sistema triplo-híbrido permitiu a identificação de seqüências de ligação consenso para as três proteínas APUM. Análises computacionais identificaram elementos de ligação a APUM em regiões 3\' UTR de importantes transcritos relacionados ao controle do meristema do caule e à manutenção das células totipotentes. Nós mostramos que os homólogos APUM-l, APUM-2 e APUM-3 reconhecem elementos de ligação a APUM nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-2. Ensaios de RT-PCR e Western blot semiquantitativos mostraram que a quantidade dos transcritos WUSHEL e CLAVATA-1 é alterada em plantas antisenso induzíveis para APUM-l, APUM-2 e APUM-3. A relevância biológica dessas interações foi observada através de ensaios de coimunoprecipitação, confirmando, portanto, o primeiro caso de regulação traducional descrito para os mensageiros WUSCHEL e CLAVATA-1. Análises computacionais adicionais para a identificação de outros homólogos PUF em Arabidopsis encontraram vinte e cinco proteínas possuindo repetições PUF. Entre elas, os homólogos APUM-4, APUM-S e APUM-6 apresentam alta similaridade com as proteínas APUM-l, APUM-2 e APUM-3, sendo capazes de ligar especificamente à seqüência NRE e aos elementos de ligação a APUM presentes nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-ts resultados indicam que vários homólogos PUF podem agir como reguladores traducionais em Arabidopsis através de um mecanismo molecular conservado entre as espécies, podendo abrir uma nova área de investigação da regulação de mRNA em plantas.