Descrição morfológica e posicionamento filogenético de um lagarto (Reptilia, Squamata) do Mioceno Inferior da Formação Chichínales, General Roca, Província de Río Negro, Argentina

Embora os escamados sejam comumente encontrados em sítios fossilíferos cenozóicos sul−americanos, materiais esqueléticos completos são raros. Apenas alguns poucos exemplares assim foram registrados, com a maioria dos achados representando materiais fragmentários de crânio e mandíbulas ou vértebras isoladas. Dentre as localidades provedoras de vertebrados fósseis na América do Sul, a Formação Chichínales se destaca pela recente descoberta, em seus sedimentos, de um crânio quase completo de um lagarto teiídeo previamente desconhecido. Dada a fauna associada, a idade da formação é definida como Mioceno Temprano (Colhuehuapense). No presente estudo, conclui−se, através de uma análise filogenética contendo 39 espécies viventes e fósseis de escamados e 149 caracteres osteológicos, que este material pertence a uma nova espécie do gênero contemporâneo Callopistes. Uma descrição morfológica detalhada do fóssil, obtida através de análises estereoscópicas e de microtomografia computadorizada de alta resolução (CT Scan), também é apresentada. A matriz morfológica foi analisada com o auxílio do software TNT Versão 1.1, seguindo o princípio de máxima parcimônia, com todos os caracteres tratados com a mesma pesagem, resultando em quatro árvores igualmente parcimoniosas, que foram então utilizadas para a construção de uma árvore de consenso estrito. Em todas as quatro árvores, o novo táxon posicionou−se dentro da família Teiidae como um membro do clado formado pelas demais espécies viventes de Callopistes. Entretanto, não foi possível estabelecer uma relação de grupo−irmão inequívoca entre as duas espécies de Callopistes presentes na análise e o fóssil. A atual distribuição das duas espécies viventes de Callopistes e a localidade de onde foi recuperado o fóssil em estudo indicam que esse gênero possuía uma distribuição muito mais ampla no passado, chegando a áreas patagônicas cis−Andinas, diferentemente das áreas trans−Andinas de altitude onde as duas espécies atuais estão restritas

Padronização e validação de marcadores moleculares para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar

O diagnóstico da leishmaniose tegumentar (LT) baseia-se em critérios clínicos e epidemiológicos podendo ser confirmado por exames laboratoriais de rotina como a pesquisa direta do parasito por microscopia e a intradermorreação de Montenegro. Atualmente, os métodos moleculares, principalmente a reação da cadeia da polimerase (PCR), têm sido considerados para aplicação em amostras clínicas, devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Este trabalho teve como objetivo a padronização e validação das técnicas de PCR-RFLP com diferentes iniciadores (kDNA, its1, hsp70 e prp1), visando o diagnóstico e a identificação das espécies de Leishmania presentes em amostras de DNA provenientes de lesões de pele ou mucosa de 140 pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar. Para tal, realizamos ensaios de: 1) sensibilidade das PCRs com os diferentes iniciadores, 2) especificidade dos ensaios utilizando DNAs de diferentes espécies de referência de Leishmania, de tripanossomatídeos inferiores e de fungos, 3) validação das técnicas de PCR-RFLP com os iniciadores estudados em amostras de DNA de lesões de pele ou mucosas de pacientes com LT. Os resultados dos ensaios de limiar de detecção das PCR (sensibilidade) mostraram que os quatro iniciadores do estudo foram capazes de detectar o DNA do parasito, porém em quantidades distintas: até 500 fg com os iniciadores para kDNA e its1, até 400 fg com hsp70 e até 5 ng com prp1. Quanto à especificidade dos iniciadores, não houve amplificação dos DNAs fúngicos. Por outro lado, nos ensaios com os iniciadores para kDNA e hsp70, verificamos amplificação do fragmento esperado em amostras de DNA de tripanossomatídeos. Nos ensaios com its1 e prp1, o padrão de amplificação com os DNAs de tripanossomatídeos foi diferente do apresentado pelas espécies de Leishmania. Verificou-se nos ensaios de validação que o PCR-kDNA detectou o parasito em todas as 140 amostras de DNA de pacientes e, assim, foi utilizado como critério de inclusão das amostras. A PCR-its1 apresentou menor sensibilidade, mesmo após a reamplificação com o mesmo iniciador (85,7% ou 120/140 amostras). Para os ensaios da PCR-hsp70, as amostras de DNA foram amplificadas com Repli G, para obter uma sensibilidade de 68,4% (89/140 amostras). A PCR-prp1 não detectou o parasito em amostras de DNA dos pacientes. Quanto aos ensaios para a identificação da espécie presente na lesão, a PCR-kDNA-RFLP-HaeIII e a PCR-its1- RFLP-HaeIII permitem a distinção de L. (L.) amazonensis das outras espécies pertencentes ao subgênero Viannia. A PCR-hsp70-RFLP-HaeIII-BstUI, apesar de potencialmente ser capaz de identificar as seis espécies de Leishmania analisadas, quando utilizada na avaliação das amostras humanas permitiu apenas a identificação de L. (V.) braziliensis. No entanto, é uma técnica com várias etapas e de difícil execução, o que pode inviabilizar o seu uso rotineiro em centros de referência em diagnósticos. Assim, recomendamos o uso dessa metodologia apenas em locais onde várias espécies de Leishmania sejam endêmicas. Finalmente, os resultados indicam que o kDNA-PCR devido à alta sensibilidade apresentada e facilidade de execução pode ser empregada como exame de rotina nos centros de referência, permitindo a confirmação ou exclusão da LT.