Participação do nicho endosteal na regulação da hemopoese de camundongos submetidos à desnutrição proteica

O nicho endosteal da medula óssea abriga as células-tronco hemopoéticas (CTH) em quiescência/autorrenovação. As CTH podem ser classificadas em dois grupos: células que reconstituem a hemopoese em longo prazo (LT-CTH) e curto prazo (CT-CTH). Investigamos, neste trabalho, os efeitos da desnutrição proteica (DP) no tecido ósseo e a participação do nicho endosteal na sinalização osteoblasto-CTH. Para tanto, utilizamos camundongos submetidos à DP induzida pelo consumo de ração hipoproteica. Os animais desnutridos apresentaram pancitopenia e diminuição nas concentrações de proteínas séricas e albumina. Quantificamos as CTH por citometria de fluxo e verificamos que os desnutridos apresentaram menor porcentagem de LT-CTH, CT-CTH e de progenitores multipotentes (PMP). Avaliamos a expressão das proteínas CD44, CXCR4, Tie-2 e Notch-1 nas LT-CTH. Observamos diminuição da expressão da proteína CD44 nos desnutridos. Isolamos as células LT-CTH por cell sorting e avaliamos a expressão gênica de CD44, CXCR4 e NOTCH-1. Verificamos que os desnutridos apresentaram menor expressão de CD44. Em relação ao ciclo celular, verificamos maior quantidade de LT-CTH nas fases G0/G1. Caracterizamos as alterações do tecido ósseo femoral, in vivo. Observamos diminuição da densidade mineral óssea e da densidade medular nos desnutridos. A desnutrição acarretou diminuição da área média das seções transversais, do perímetro do periósteo e do endósteo na cortical do fêmur dos animais. E na região trabecular, verificou-se diminuição da razão entre volume ósseo e volume da amostra e do número de trabéculas, aumento da distância entre as trabéculas e prevalência de trabéculas ósseas em formato cilíndrico. Avaliamos a expressão de colágeno, osteonectina (ON) e osteocalcina (OC) por imuno-histoquímica, e de osteopontina (OPN) por imunofluorescência no fêmur e verificamos diminuição da marcação para OPN, colágeno tipo I, OC e ON nos desnutridos. Evidenciamos, pela técnica do Picrosírius, desorganização na distribuição das fibras colágenas e presença de fibras tipo III nos fêmures dos desnutridos, além de maior número de osteoclastos evidenciados pela reação da fosfatase ácida tartarato resistente. Os osteoblastos da região femoral foram isolados por depleção imunomagnética, imunofenotipados por citometria de fluxo e cultivados em meio de indução osteogênica. Observamos menor positividade para fosfatase alcalina e vermelho de alizarina nas culturas dos osteoblastos dos desnutridos. Avaliamos, por Western Blotting, a expressão de colágeno tipo I, OPN, osterix, Runx2, RANKL e osteoprotegerina (OPG), e, por PCR em tempo real, a expressão de COL1A2, SP7, CXCL12, ANGPT1, SPP1, JAG2 e CDH2 nos osteoblastos isolados. Verificamos que a desnutrição acarretou diminuição da expressão proteica de osterix e OPG e menor expressão gênica de ANGPT1. Avaliamos a proliferação das células LSK (Lin-Sca1+c-Kit+) utilizando ensaio de CFSE (carboxifluoresceína succinimidil ester). Foi realizada cocultura de células LSK e osteoblastos (MC3T3-E1) na presença e ausência de anti-CD44. Após uma semana, verificamos menor proliferação das LSK dos desnutridos. O bloqueio de CD44 das LSK do grupo controle diminuiu a proliferação destas em três gerações. Entretanto, nos desnutridos, esse bloqueio não afetou a proliferação. Concluímos que a DP promoveu alterações no tecido ósseo e nas CTH. Entretanto, não podemos afirmar que as alterações observadas no sistema hemopoético foram decorrentes de alterações exclusivas do nicho endosteal.

Identificação e caracterização de RNA mensageiros candidatos a alvo das proteínas PUMILHO de Arabidopsis através do sistema triplo-híbrido de levedura

Proteínas PUF regulam a estabilidade e a tradução através da ligação a seqüências específicas nas regiões 3\' não traduzidas (3\' UTR) dos mensageiros. A ligação é mediada por um domínio de ligação conservado constituído por 8 repetições de aproximadamente 36 aminoácidos cada. Experimentos realizados no sistema triplo-híbrido de levedura mostraram que os homólogos PUF de Arabidopsis APUM-1, APUM-2 e APUM-3 são capazes de ligar especificamente à seqüência chamada de Elemento de Resposta a NANOS (NRE) reconhecida pelo homólogo PUF de Drosophila. A utilização de bibliotecas de expressão de RNA em ensaios no sistema triplo-híbrido permitiu a identificação de seqüências de ligação consenso para as três proteínas APUM. Análises computacionais identificaram elementos de ligação a APUM em regiões 3\' UTR de importantes transcritos relacionados ao controle do meristema do caule e à manutenção das células totipotentes. Nós mostramos que os homólogos APUM-l, APUM-2 e APUM-3 reconhecem elementos de ligação a APUM nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-2. Ensaios de RT-PCR e Western blot semiquantitativos mostraram que a quantidade dos transcritos WUSHEL e CLAVATA-1 é alterada em plantas antisenso induzíveis para APUM-l, APUM-2 e APUM-3. A relevância biológica dessas interações foi observada através de ensaios de coimunoprecipitação, confirmando, portanto, o primeiro caso de regulação traducional descrito para os mensageiros WUSCHEL e CLAVATA-1. Análises computacionais adicionais para a identificação de outros homólogos PUF em Arabidopsis encontraram vinte e cinco proteínas possuindo repetições PUF. Entre elas, os homólogos APUM-4, APUM-S e APUM-6 apresentam alta similaridade com as proteínas APUM-l, APUM-2 e APUM-3, sendo capazes de ligar especificamente à seqüência NRE e aos elementos de ligação a APUM presentes nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-ts resultados indicam que vários homólogos PUF podem agir como reguladores traducionais em Arabidopsis através de um mecanismo molecular conservado entre as espécies, podendo abrir uma nova área de investigação da regulação de mRNA em plantas.

Aproximação facial forense: relação entre as estruturas ósseas e a porção inferior do nariz

Este trabalho teve o propósito de avaliar a relação entre a cartilagem alar e a abertura piriforme a partir de imagens de tomografia computadorizada cone-beam e a relação do nariz com o padrão esquelético vertical da face. A pesquisa foi realizada com 96 imagens de indivíduos de ambos os sexos (49 masculino e 47 feminino), com idades entre 18 e 65 anos classificados de acordo com sua tipologia facial. Para a realização das marcações e mensurações de interesse foi utilizado o software OsiriX. A tipologia facial foi acessada através de três metodologias: índice facial, ângulo goníaco e proporção entre as alturas faciais. No corte axial da imagem de tomografia computadorizada, foram aferidas quatro grandezas lineares: largura do nariz externo, distância entre as inserções alares, extensão da base da abertura piriforme e máxima largura da abertura piriforme. Todas as grandezas foram mensuradas por dois examinadores em concordância. A análise dos resultados obtidos mostrou que há correlação entre as larguras do nariz externo e da abertura piriforme e entre a base da cavidade nasal e a distância entre as inserções alares. A largura da abertura piriforme aumenta proporcionalmente mais que a do nariz. Além disso, a tipologia facial longa associa-se à largura nasal.

Estudos de proteômica, estruturais e funcionais de proteínas envolvidas na degradação da biomassa lignocelulósica: expansinas microbianas e hidrolases de glicosídeos termofílicas

O Brasil possui uma posição privilegiada quando se refere à produção de etanol. Por questões históricas e geográficas o país é responsável por mais de 30 % da produção mundial de etanol, com uma produção nacional de mais de 28 bilhões de litros em 2014. Para maximizar o rendimento desse processo, está em desenvolvimento a tecnologia associada ao etanol de segunda geração ou etanol lignocelulósico. Os principais desafios desta tecnologia são: melhorar a eficiência de conversão do substrato em produto e a produção em grande escala utilizando substratos de baixo custo. Com o objetivo de melhorar a eficiência do processo de conversão foram estudadas proteínas auxiliares (expansinas) que, em conjunto com celulases, melhoram a despolimerização de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis. Além disso, realizou-se também a caracterização de enzimas ativas de carboidratos (CAZymes) de origem termofílica do organismo Thermogemmatispora sp. T81, devido a capacidade que estas proteínas apresentam de manter a atividade e conformação estrutural em altas temperaturas por um prolongado período de tempo. A partir de análises utilizando bioinformática, os genes que codificam para expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei foram clonados e expressos em E. coli, e seus produtos gênicos (as expansinas) tiveram seus índices de sinergismo (devido atuação conjunta com coquetéis comerciais) e atividade catalítica determinados. Adicionalmente, dispondo de alinhamentos estruturais, foi proposto um mecanismo hidrolítico para elas. Em relação à bactéria Thermogemmatispora sp. T81, foram realizadas análises genômicas e proteômicas, a fim de selecionar enzimas superexpressas em meio celulósico. Seus genes foram clonados heterologamente em E. coli e o produto de expressão caracterizado bioquimicamente (cromatografia, ensaios de atividade e perfil de hidrólise) e estruturalmente (SAXS e dicroísmo circular). Os índices de sinergismo determinados foram de 2,47; 1,96 e 2,44 para as expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei, respectivamente. A partir dos alinhamentos estruturais foi proposto a díade Asp/Glu como sitio catalítico em expansinas. As análises de proteômica possibilitaram a seleção de quatro alvos de clonagem, por apresentarem alto índice de expressão quando a bactéria foi cultivada em meio celulósico. Estas proteínas foram caracterizadas quanto a atividade e apresentaram um perfil comum: temperatura ótima de ação (de 70 a 75 °C), pH ótimo de 5, e hidrolisam preferencialmente substratos hemicelulósicos (xilano). A porcentagem de estruturais secundárias das proteínas em estudo foram confirmadas com predições teóricas ao se utilizar a técnica de dicroísmo circular. Desta maneira, os objetivos iniciais propostos neste projeto foram concluídos com a determinação do grau de sinergismo das proteínas expansinas em estudo e a proposição de um mecanismo de hidrólise para as mesmas, considerando que tais proteínas por mais de 20 anos tiveram sua atividade definida exclusivamente como acessória. Além disso, este estudo contribui com a identificação e seleção de genes para CAZymes termofilícas com aplicação biotecnológica devido às propriedades termoestáveis apresentadas.

Análise funcional das proteínas HrcA, GroES/GroEL e DnaK/DnaJ em Caulobacter crescentus

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico σ32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem.

Análise de metabólitos e proteínas totais em folhas de Eucalyptus grandis durante a infecção por Puccinia psidii

Os mecanismos moleculares envolvidos na resistência de plantas contra patógenos são um tema bastante discutido no meio acadêmico, sendo o objetivo maior dos estudos a diminuição das perdas de produtividade provocadas por doenças em plantações do mundo todo. Muitos modelos de interação patógeno-hospedeiro foram propostos e desenvolvidos priorizando plantas e culturas de rápido desenvolvimento com ciclo de vida curto. Espécies de ciclo longo, porém, devem lidar durante anos - ao menos até a idade reprodutiva - contra o ataque de bactérias, fungos e vírus, sem contar, nesse meio tempo, com recombinações genéticas e mutações que tornariam possível o escape contra as moléstias causadas por microrganismos. Assim, como alternativa aos modelos usuais, o presente trabalho estudou um diferente par de antagonistas: Eucalyptus grandis e Puccinia psidii. Apesar da contribuição de programas de melhoramento genético, o patossistema E. grandis X P. psidii ainda é pouco descrito no nível molecular, havendo poucos estudos sobre os processos e as moléculas que agem de forma a conferir resistência às plantas. Assim, buscando o melhor entendimento da relação entre E. grandis X P. psidii, o presente trabalho estudou a mudança dos perfis de proteínas e metabólitos secundários ocorrida nos tecidos foliares de plantas resistentes e susceptíveis durante a infecção pelo patógeno, com o auxílio da técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. Os resultados obtidos indicam que as plantas resistentes percebem a presença do patógeno logo nas primeiras horas pós-infecção, produzindo proteínas ligadas à imunidade (HSP90, ILITYHIA, LRR Kinase, NB-ARC disease resistance protein). Essa percepção desencadeia a produção de proteínas de parede celular e de resposta oxidativa, além de modificar o metabolismo primário e secundário. As plantas susceptíveis, por outro lado, têm o metabolismo subvertido, produzindo proteínas responsáveis pelo afrouxamento da parede celular, beneficiando a absorção de nutrientes, crescimento e propagação de P. psidii. No trabalho também são propostos metabólitos biomarcadores de resistência, moléculas biomarcadoras de resposta imune e sinais da infecção por patógeno em E. grandis.

Impacto do pH final na maciez do músculo Longissimus lumborum de animais zebuínos: mudanças estruturais de proteínas da carne crua e cozida durante a maturação

O objetivo do presente trabalho foi determinar a força de cisalhamento Warner-Bratzler do músculo Longissimus lumborum de animais zebuínos machos inteiros (Bos indicus) durante o período de maturação, nas faixas de pH final (pHf 48 horas post mortem) normal (pH entre 5,5 e 5,8) e anormal (pH entre 5,81 e 6,19) e temperaturas internas de cozimento. Concomitante com a avaliação de força de cisalhamento, foram avaliadas também a degradação da desmina e troponina T, o comprimento do sarcômero, o teor de colágeno total e solúvel, as temperaturas máximas de desnaturação das proteínas e a morfologia geral de agregação das fibras do músculo no cozimento. A degradação da desmina e troponina T foi maior no pHf normal, aparecendo produtos de degradação a partir do dia 7 nessa faixa de pHf. Não houve diferenças nos valores de comprimento do sarcômero, descartando-se assim, a contribuição desse parâmetro sobre a temperatura máxima de desnaturação (Tmáx) das proteínas, determinada utilizando calorímetro exploratório diferencial (DSC). Similarmente, não foram encontradas diferenças para os teores de colágeno total e solúvel, e os valores de colágeno total foram baixos, sugerindo que sua contribuição na segunda transição térmica e nos valores de força de cisalhamento foi mínima. As Tmáx1 e Tmáx2, correspondentes à desnaturação da meromiosina leve e pesada, respectivamente, foram menores no pHf normal, mas o efeito foi maior para a Tmáx2. A Tmáx3 da actina e titina aumentou até 14 dias post mortem na faixa de pHf normal, e posteriormente diminuiu significativamente após 21 dias, sugerindo possível degradação dessas proteínas nesse período de dias. Não foram encontradas diferenças nos valores de Tmáx no pHf anormal, em todos os dias post mortem, o que sugere a contribuição de um possível mecanismo de proteção que estabiliza as miofibrilas no aquecimento. Houve maior agregação das fibras do músculo no pHf normal nas temperaturas internas de cozimento de 65 e 80°C, provavelmente devido à maior desnaturação térmica das miofibrilas. Os valores de força de cisalhamento foram maiores com o aumento da temperatura interna de cozimento, devido ao aumento da desnaturação térmica das miofibrilas do músculo. Independente da temperatura interna de cozimento, os valores de força de cisalhamento foram altos em quase todos os dias post mortem para ambas as faixas de pHf, o que sugere a necessidade de utilizar métodos físicos ou químicos para aumentar a maciez do músculo Longissimus lumborum de animais zebuínos.

Componentes genéticos que afetam a via de direcionamento de proteínas organelares em Arabidopsis thaliana

Nos eucariotos, a evolução dos sistemas de transporte molecular foi essencial pois seu alto grau de compartimentalização requer mecanismos com maior especificidade para a localização de proteínas. Com o estabelecimento das mitocôndrias e plastídeos como organelas da célula eucariota, grande parte dos genes específicos para sua atividade e manutenção foram transferidos ao núcleo. Após a transferência gênica, a maioria das proteínas passaram a ser codificadas pelo núcleo, sintetizadas no citosol e direcionadas às organelas por uma maquinaria complexa que envolve receptores nas membranas das organelas, sequências de direcionamento nas proteínas e proteínas citossólicas que auxiliam o transporte. A importação depende em grande parte de uma sequência na região N-terminal das proteínas que contém sinais reconhecidos pelas membranas organelares. No entanto, muito ainda não é compreendido sobre o transporte de proteínas organelares e fatores ainda desconhecidos podem influenciar o direcionamento sub-celular. O objetivo deste trabalho foi a caracterização da General Regulatory Factor 9 (GRF9), uma proteína da família 14-3-3 de Arabidopsis thaliana potencialmente envolvida no direcionamento de proteínas organelares, e a geração de um genótipo para ser utilizado na obtenção de uma população mutante para genes que afetam o direcionamento da proteína Tiamina Monofosfato Sintetase (TH-1). Após experimentos in vivo e in planta, foi observado que GRF9 interage com as proteínas duplo-direcionadas Mercaptopyruvate Sulfurtransferase1 (MST1) e a Thiazole Biosynthetic Enzyme (THI1), e com a proteína direcionada aos cloroplastos TH-1. Experimentos de deleção e interação in vivo mostraram que a região Box1 de GRF9 é essencial para a interação com THI1 e MST1. Com a finalidade de dar continuidade a caracterização da GRF9 e para realização de testes com relação a sua função no direcionamento de proteínas organelares foi gerada uma linhagem homozigota que superexpressa GRF9. Plantas expressando o transgene TH-1 fusionado a Green Fluorescent Protein (GFP) em genótipo deficiente na TH-1 (CS3469/TH-1-GFP) foram obtidas para a geração de população mutante que possibilitará a descoberta de componentes genéticos ainda desconhecidos e responsáveis pelo direcionamento de proteínas aos cloroplastos.