Efeito da desnutrição proteica sobre aspectos da mobilização, migração e sinalização celular. Papel da glutamina na modulação desses processos

A desnutrição é uma condição nutricional que pode afetar muitos aspectos da resposta imunológica, como alterações na migração celular, na fagocitose, na resposta bactericida, mudanças na produção de radicais livres e espécies de nitrogênio e na produção de citocinas pró-inflamatórias. Logo, indivíduos desnutridos apresentam maior susceptibilidade a infecções. Visto que a glutamina é um aminoácido de extrema importância para a funcionalidade de diversas células do sistema imune e que as mesmas apresentam aumento da utilização desse aminoácido durante processos infecciosos, investigou-se, neste trabalho, quais os efeitos da glutamina sobre alguns aspectos da mobilização, migração e sinalização celular em um modelo experimental de desnutrição proteica. Para tanto, utilizou-se camundongos da linhagem BALB/c machos, os quais foram divididos em dois grupos, Controle e Desnutrido, que passaram a receber dietas isocalóricas contendo 12% (normoproteica) e 2% de caseína (hipoproteica), respectivamente, durante 5 semanas. Para as avaliações in vivo, animais de ambos os grupos receberam por via endovenosa 100µL de solução contendo 1,25µg de LPS e após 1 hora 0,75mg/Kg de L-glutamina (GLUT). Após o período de desnutrição ou de indução ao processo inflamatório, os animais foram eutanasiados e as amostras biológicas coletas. Foram avaliados nos animais estimulados in vivo hemograma, mielograma, as citocinas IL-10 e TNF-α circulantes e a expressão de CD11b/CD18 nos granulócitos do sangue periférico. Foi avaliado, in vitro, a capacidade migratória, a expressão de CD11b/CD18 de polimorfonucleados da medula óssea e do sangue periférico, bem como a síntese de citocinas IL-1α, IL-6, IL-10, IL-12 e TNF-α e a expressão de NF-κB e IκBα em células cultivadas em meio com 0; 0,6; 2 e 10 mM de GLUT. Os animais desnutridos apresentaram anemia, leucopenia, hipoplasia medular e diminuição na concentração sérica de proteínas, albumina e pré-albumina. A GLUT, in vitro, apresentou capacidade de reduzir a produção de IL-1α e IL-6, bem como a ativação da via do NF-κB. No modelo in vivo a GLUT, em animais estimulados com LPS, alterou a cinética de migração neutrofílica e reduziu a expressão de CD18, bem como diminuiu os níveis de TNFα circulantes.

Efeitos do ramipril sobre a doença periodontal induzida experimentalmente em ratos

A doença periodontal (DP) corresponde a um grupo de doenças inflamatórias que acomete as estruturas periodontais de proteção e de suporte e pode levar à perda dentária. A etiologia está relacionada à placa dentobacteriana que leva à produção de grande quantidade de citocinas pró-inflamatórias importantes na destruição tecidual. A angiotensina (Ang) II também pode contribuir para a inflamação e destruição tecidual no periodonto agindo como mediador chave. A utilização de drogas que atuem na cascata do sistema renina-angiotensina (SRA) poderia interferir no estado de saúde ou inflamação do tecido mole, na perda óssea alveolar e na expressão gênica dos componentes do SRA e mediadores inflamatórios. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investigar se o ramipril, um inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA), altera a progressão da DP induzida experimentalmente em ratos. Foi utilizado o modelo de indução da DP por colocação de ligadura ao redor do primeiro molar inferior direito de ratos. Os grupos com 10 animais cada, foram divididos em tratados com ramipril (via gavagem 10 mg/kg/dia) ou água (veículo) durante 14 e 21 dias e o grupo Sham submetido à indução fictícia da DP. Outros quatro grupos foram submetidos ao pré-tratamento com ramipril durante os períodos de 7 e 14 dias e após a indução da DP e tratados por 14 ou 21 dias. As metodologias de avaliação foram: extração de RNA total, transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa (RTqPCR), análises histológica e da perda óssea alveolar. Os dados foram analisados por meio de gráficos e os resultados foram submetidos à análise unidirecional de variância (ANOVA) e representaram médias e respectivos desvios-padrão. Diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05. Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que o ramipril foi capaz de reduzir a progressão da perda óssea no grupo tratado por 21 dias (DP-21d-Rami), entretanto houve aumento do processo inflamatório, além de alteração da expressão de RNAm de ECA-2 e do receptor Mas, alguns mediadores do processo inflamatório, como COX2 e VEGF, e os receptores VEGF-R1 e VEGF-R2.

O estudo das células Tγδ na manutenção da tolerância materna em vacas gestantes

O sistema imunológico materno desempenha um papel importante no estabelecimento da gestação e desenvolvimento de concepto até início do parto. A hipótese deste projeto é que há um recrutamento de células Tγδ para o endométrio ao longo da gestação que expressam citocinas que favorecem o estabelecimento e manutenção da tolerância materna a antígenos fetais durante a gestação em bovinos. Experimento I Para estudar a dinâmica populacional das células do sistema imune no sangue periférico de não lactantes não prenhes (NLNP), vacas lactantes no 1º trimestre e vacas no 3º trimestre da gestação, as PBMCs foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll, seguido por protocolo de imunocitoquímica e analisadas em citômetro de fluxo para os anticorpos CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ e WC1+. As células analisadas tanto na região de linfócitos quanto na região de monócitos, não apresentaram diferença significativa entre os grupos analisados. Experimento II Para análise do perfil de expressão gênica das células Tγδ, foram coletadas amostras de sangue de vacas no 1º trimestre da gestação, vacas lactantes não prenhes (LNP) e vacas não lactantes não prenhes (NLNP). As células mononucleares foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll e células Tγδ foram analisadas quanto ao perfil de citocinas por qRT-PCR para os genes IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 e TNFA. A análise de expressão gênica mostrou tendência no aumento na expressão de IL1B, IL6 e TGFB2 em células PBMC em vacas NLNP quando comparado com vacas LNP e no 1º trimestre da gestação, enquanto que os outros genes analisados não apresentaram diferença significativa. Experimento III Fragmentos de endométrio, provenientes de abatedouro, foram coletados de vacas em 1º trimestre (33 a 35 dias de gestação), 2º trimestre (143 a 182 dias de gestação) e 3º trimestre de gestação (228 a 247 dias de gestação). Cortes congelados foram imunolocalizados e quantificados para as células do sistema imune CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+ e WC1+ por imunofluorescência. Nossos estudos mostraram aumento das células CD25+ e CD62L+ no endométrio no início da gestação. No meio da gestação, há um aumento das células WC1+ e CD14+. No final da gestação, observamos o aumento de CD14+, CD25+, CD18+ e CD62L+. Em suma, nossos dados sugerem que a modulação do sistema imune materno é específica para cada estágio da gestação, sendo que no início da gestação há um envolvimento de células T ativadas (CD25+) provavelmente para o estabelecimento de uma resposta ativa para tolerância dos antígenos fetais. Já no meio da gestação, há um recrutamento massivo de células Tγδ para o endométrio gravídico provavelmente para manter um microambiente de tolerância para o desenvolvimento fetal e no final da gestação células efetoras como macrófagos são recrutadas para o endométrio para auxiliar no processo do parto e involução uterina.

PGC-1 alfa como regulador inflamatório na esteato-hepatite não-alcoólica

A doença hepática gordurosa não-alcoólica (NAFLD, do inglês) é a manifestação clínica hepática da síndrome metabólica, cuja incidência aumenta consideravelmente em todo o mundo. A NAFLD pode progredir para um estado de esteatohepatite não-alcoólica (NASH, do inglês), caracterizado por inflamação hepatocelular, com ou sem fibrose. Dados na literatura mostram que o coativador-1 alfa do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama (PGC-1alfa), além de estar envolvido em diversos processos metabólicos, representa uma estratégia terapêutica promissora na modulação da inflamação. Neste projeto investigamos as alterações inflamatórias no fígado induzida por dieta hiperlipídica e o papel do PGC-1alfa nesse processo. Camundongos C57black/6 receberam dieta hiperlipídica contendo 30% de gordura por 10 semanas. O peso dos animais foi avaliado semanalmente. Após a eutanásia, o tecido adiposo intra-abdominal (retroperitoneal e periepididimal) foi coletado e pesado. Analisamos o perfil glicêmico e lipídico sérico e expressão de genes envolvidos no metabolismo glicêmico e lipídico. Avaliou-se também o aspecto histológico e a inflamação do tecido hepático por quantificação das citocinas IL-6, TNF-alfa e IL-1beta. A dieta rica em gordura conduziu a um aumento dos depósitos de gordura intra-abdominal, hiperglicemia e hiperlipidemia. Os animais também apresentavam esteatohepatite, com aumento de citocinas pró-inflamatórias e diminuição na expressão de PGC-1alfa no tecido hepático. O envolvimento do PGC-1alfa na produção de mediadores inflamatórios por hepatócitos foi avaliado em células HepG2 utilizando RNA de interferência (RNAi). O knockdown da expressão de PGC-1alfa causou aumento na expressão e liberação de IL-6 em hepatócitos via aumento na fosforilação de IkBalfa e consequente ativação do NFkB. Portanto, nossos dados mostram que o PGC-1alfa inibe a produção de mediadores inflamatórios (IL-6) em hepatócitos, e fornecem novas evidências das conexões existentes entre as vias metabólicas e imunes

Alterações na resposta imune inata e adaptativa induzidas por Escherichia coli enteroinvasora em modelo murino

Durante uma infecção, uma complexa seqüência de eventos é inkiada após a invasão do hospedeiro por microrganismos patogênicos. Escherichia coli enteroinvasora (EIEC), assim como Shigella, causa disenteria através da invasão da mucosa do cólon, levando à destruição tecidual e inflamação. Para que ocorra um processo infeccioso, porém, são necessários inóculos de 102 Shigella e 106 EIEC. Foram avaliados aspectos da resposta inflamatória desencadeada pela infecção por EIEC em modelo murino, comparativamente a Shigella. A infecção de macrófagos J774 por EIEC resultou em fagocitose bacteriana, comprometimento da viabilidade do macrófago e produção de citocinas. Macrófagos de camundongos C57BU6 infectados com EIEC produziram NO, que parece ser importante no controle da infecção. Foi observado que camundongos INOS nocaute apresentaram maior produção de citocinas pró-inflamatórias e maior letalidade após infecção do que os selvagens. EIEC induziu a migração de granulócitos e monócitos para o peritônio, e a secreção de citocinas por estas células. Houve proliferação de linfócitos em resposta aos antígenos solúveis de EIEC, mas não foi detectada produção de citocinas por estes linfócitos.Comparativamente a Shigella, EIEC escapou mais lentamente do macrófago, induziu menor produção de citocinas pró-inflamatórias e NO, e menor ativação dos linfócitos T. Estes dados sugerem o desafio com EIEC desencadeia uma resposta menos severa no hospedeiro do que Shigella, o que explicaria a forma mais branda de disenteria e resolução mais rápida do processo infeccioso causado por EIEC.