Caracterização genotípica de Arcobacter spp. isolados de carnes de aves comercializadas no Município de São Paulo - SP

Arcobacter spp. é um micro-organismo Gram negativo que provoca diarreia aquosa e sepse em seres humanos. A. butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowii são espécies patogênicas para humanos. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de Arcobacter spp. na carne de aves comercializadas em açougues na cidade de São Paulo, verificando os genes de virulência e o perfil genotípico. Um total de 300 cortes de carne de frango foram submetidos ao cultivo e isolamento sob condições aeróbicas, a 30°C por 72 horas. Colônias suspeitas de Arcobacter spp. foram selecionadas para a detecção molecular pela reacção em cadeia da polimerase (PCR), a fim de determinar as espécies e os genes de virulência. Os resultados revelaram a presença de Arcobacter spp. em 18.3% (55/300) de amostras de carne de aves, sendo identificado como A. butzleri 63,6% (35/55) e A. cryaerophilus 36,3% (20/55). Os genes de virulência pesquisados demonstraram positividade de 100% (55/55) para o ciaB e mviN, seguidos de cj1349 98,1% (54/55), pldA 94,4% (52/55), cadF 72,7% (40/55), tlyA 92,7% (51/55), hecA 49% (27/55), irgA 47,2% (26/55) e hecB 34,5% (19/55). Estas cepas foram submetidas ao AFLP gerando dois dendogramas. Foram identificados 19 perfis genotípicos para A. butzleri e 17 para A. cryaerophilus. Os resultados desta pesquisa apontam a presença de A. butzleri e A. cryaerophilus na fase final da distribuição de carne de frangos nos açougues. A falta de inocuidade dos alimentos de origem animal, bem como a presença de estirpes virulentas representam riscos de Saúde Pública, com especial atenção para a possibilidade de contaminação cruzada gerados por alimentos crus e utensílios de cozinha

Padronização e validação de marcadores moleculares para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar

O diagnóstico da leishmaniose tegumentar (LT) baseia-se em critérios clínicos e epidemiológicos podendo ser confirmado por exames laboratoriais de rotina como a pesquisa direta do parasito por microscopia e a intradermorreação de Montenegro. Atualmente, os métodos moleculares, principalmente a reação da cadeia da polimerase (PCR), têm sido considerados para aplicação em amostras clínicas, devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Este trabalho teve como objetivo a padronização e validação das técnicas de PCR-RFLP com diferentes iniciadores (kDNA, its1, hsp70 e prp1), visando o diagnóstico e a identificação das espécies de Leishmania presentes em amostras de DNA provenientes de lesões de pele ou mucosa de 140 pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar. Para tal, realizamos ensaios de: 1) sensibilidade das PCRs com os diferentes iniciadores, 2) especificidade dos ensaios utilizando DNAs de diferentes espécies de referência de Leishmania, de tripanossomatídeos inferiores e de fungos, 3) validação das técnicas de PCR-RFLP com os iniciadores estudados em amostras de DNA de lesões de pele ou mucosas de pacientes com LT. Os resultados dos ensaios de limiar de detecção das PCR (sensibilidade) mostraram que os quatro iniciadores do estudo foram capazes de detectar o DNA do parasito, porém em quantidades distintas: até 500 fg com os iniciadores para kDNA e its1, até 400 fg com hsp70 e até 5 ng com prp1. Quanto à especificidade dos iniciadores, não houve amplificação dos DNAs fúngicos. Por outro lado, nos ensaios com os iniciadores para kDNA e hsp70, verificamos amplificação do fragmento esperado em amostras de DNA de tripanossomatídeos. Nos ensaios com its1 e prp1, o padrão de amplificação com os DNAs de tripanossomatídeos foi diferente do apresentado pelas espécies de Leishmania. Verificou-se nos ensaios de validação que o PCR-kDNA detectou o parasito em todas as 140 amostras de DNA de pacientes e, assim, foi utilizado como critério de inclusão das amostras. A PCR-its1 apresentou menor sensibilidade, mesmo após a reamplificação com o mesmo iniciador (85,7% ou 120/140 amostras). Para os ensaios da PCR-hsp70, as amostras de DNA foram amplificadas com Repli G, para obter uma sensibilidade de 68,4% (89/140 amostras). A PCR-prp1 não detectou o parasito em amostras de DNA dos pacientes. Quanto aos ensaios para a identificação da espécie presente na lesão, a PCR-kDNA-RFLP-HaeIII e a PCR-its1- RFLP-HaeIII permitem a distinção de L. (L.) amazonensis das outras espécies pertencentes ao subgênero Viannia. A PCR-hsp70-RFLP-HaeIII-BstUI, apesar de potencialmente ser capaz de identificar as seis espécies de Leishmania analisadas, quando utilizada na avaliação das amostras humanas permitiu apenas a identificação de L. (V.) braziliensis. No entanto, é uma técnica com várias etapas e de difícil execução, o que pode inviabilizar o seu uso rotineiro em centros de referência em diagnósticos. Assim, recomendamos o uso dessa metodologia apenas em locais onde várias espécies de Leishmania sejam endêmicas. Finalmente, os resultados indicam que o kDNA-PCR devido à alta sensibilidade apresentada e facilidade de execução pode ser empregada como exame de rotina nos centros de referência, permitindo a confirmação ou exclusão da LT.