Investigação de mecanismos genéticos e epigenéticos em distúrbios do crescimento humano

Parcela considerável de pacientes com distúrbios de crescimento não têm a causa de seus quadros clínicos estabelecida, incluindo aproximadamente 50% dos pacientes com diagnóstico clínico de síndrome de Silver−Russell (SRS) e 10-20% dos pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS). O objetivo deste estudo foi investigar as causas genéticas e epigenéticas de distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida, numa contribuição para o entendimento de mecanismos que regulam o crescimento. O estudo compreendeu: (1) a investigação de microdesequilíbrios cromossômicos, por aCGH; (2) a análise do perfil de expressão alelo-específica de genes sujeitos a imprinting (IG), por pirossequenciamento (PSQ) ou sequenciamento de Sanger; (3) a investigação do padrão de metilação global em pacientes com restrição de crescimento, utilizando microarray de metilação. A casuística constituiu-se de 41 pacientes não aparentados, com distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida: (1) 25, com hipótese diagnóstica de SRS; (2) seis, com restrição de crescimento intrauterino e peso ao nascimento abaixo do 10º percentil, associados a outros sinais clínicos; (3) sete, com hipótese diagnóstica de BWS; e (4) três, com macrossomia pré-natal ou pós-natal, associada a outros sinais. A investigação de microdesequilíbrios cromossômicos foi realizada em 40 pacientes. Foram detectadas 58 variantes raras em 30/40 pacientes (75%): 40 foram consideradas provavelmente benignas (18 pacientes, 45%), 12, com efeito patogênico desconhecido (11 pacientes, 27,5%), duas, provavelmente patogênicas (um paciente, 2,5%) e quatro, patogênicas (três pacientes, 7,5%). Essas frequências são comparáveis àquelas descritas em estudos que investigaram CNV em grupos de pacientes com distúrbios de crescimento e outras alterações congênitas, incluindo SRS, e mostram a importância da investigação de microdesequilíbrios cromossômicos nesses pacientes. A diversidade dos microdesequilíbrios cromossômicos identificados é reflexo da heterogeneidade clínica das casuísticas. Neste estudo, muitos dos pacientes com hipótese diagnóstica de SRS e BWS apresentavam sinais clínicos atípicos, explicando a ausência neles das alterações (epi)genéticas que causam essas síndromes. A identificação de CNV características de outras síndromes reflete a sobreposição de sinais clínicos com BWS e SRS. A análise do perfil de expressão alelo-específica de IG foi realizada em um subgrupo de 18 pacientes com restrição de crescimento. Trinta IG com função em proliferação celular, crescimento fetal ou neurodesenvolvimento foram inicialmente selecionados. Após seleção de SNP transcritos com alta frequência na população, genotipagem de pacientes, genitores e indivíduos controle, determinação da expressão dos IG em sangue periférico e seu padrão de expressão (mono ou bialélico), 13 IG, expressos no sangue, tiveram a expressão alelo-específica avaliada, sete deles por PSQ e seis por sequenciamento de Sanger. Alterações no perfil de expressão de dois genes, de expressão normalmente paterna, foram detectadas em 4/18 pacientes (22%). Este estudo é o primeiro a utilizar pirossequenciamento e sequenciamento de Sanger na avaliação do perfil de expressão alelo-específica de IG, em pacientes com restrição de crescimento. Apesar de terem limitações, ambas as técnicas mostraram-se robustas e revelaram alterações de expressão alélica interessantes; entretanto, a relação dessas alterações com o quadro clínico dos pacientes permanece por esclarecer. A investigação da metilação global do DNA foi realizada em subgrupo de 21 pacientes com restrição de crescimento e em 24 indivíduos controle. Dois tipos de análise foram realizados: (1) análise diferencial de grupo e (2) análise diferencial individual. Na primeira análise, em que foi comparado o padrão de metilação do grupo de pacientes com quadro clínico sugestivo de SRS (n=16) com o do grupo controle (n=24), não houve indicação de hipo ou hipermetilação global no grupo SRS. Na segunda análise, foi comparado o padrão de metilação de cada um dos 21 pacientes com restrição de crescimento e dos 24 indivíduos controle, com o padrão de metilação do grupo controle. O número médio de CpG hipermetilados e de segmentos diferencialmente metilados (SDM) foi significativamente maior nos pacientes. Foram identificados 82 SDM hipermetilados, estando 57 associados a gene(s) (69,5%), em 16 pacientes, e 51 SDM hipometilados, 41 deles associados a gene(s) (80,4%), em 10 pacientes. A análise de ontologia genética dos 61 genes associados aos SDM hipo ou hipermetilados nos pacientes destacou genes que atuam no desenvolvimento e na morfogênese do sistema esquelético e de órgãos fetais, e na regulação da transcrição gênica e de processos metabólicos. Alterações de metilação em genes que atuam em processos de proliferação e diferenciação celulares e crescimento foram identificadas em 9/20 dos pacientes (45%), sugerindo implicação clínica. Não foi detectada alteração epigenética comum aos pacientes com diagnóstico clínico de SRS, explicável provavelmente pela heterogeneidade clínica. A investigação de metilação global, utilizando microarray, produziu novos dados que podem contribuir para a compreensão de mecanismos moleculares que influenciam o crescimento pré- e pós-natal. Na translocação aparentemente equilibrada - t(5;6)(q35.2;p22.3)dn, detectada em paciente com suspeita clínica de SRS, a interrupção de um gene, pela quebra no cromossomo 6, pode ser a causa do quadro clínico; alternativamente, a translocação pode ter impactado a regulação de genes de desenvolvimento localizados próximos aos pontos de quebra. A análise de expressão em sangue periférico mostrou que os níveis de cDNA do gene, interrompido pelo ponto de quebra da translocação, estavam reduzidos à metade. Além de sinais típicos da SRS, a paciente apresentava algumas características clínicas sugestivas de displasia cleidocraniana. Assim, a translocação t(5;6) pode ter alterado a interação de genes de desenvolvimento e seus elementos reguladores, levando à desregulação de sua expressão espaço-temporal, e resultando num fenótipo atípico, com características sobrepostas de mais de uma síndrome genética

Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para o monitoramento dos produtos das vias metabólicas do triptofano em linhagem celular de glioma humano

O metabolismo do triptofano (Trp) se dá pela via das quinureninas (QUIN), pela via serotoninérgica (SER) e pela via das aminas traço. A primeira gera QUIN e uma variedade de outros metabólitos secundários. Quando conduzida pela enzima indolamina 2,3 dioxigenase (IDO) contribui para os fenômenos de tolerância e imune escape de células tumorais; e quando conduzida pela triptofano 2,3 dioxigenase (TDO) no fígado, participa na síntese da niacina e NAD. A via SER leva à formação do neurotransmissor serotonina (SER), que pode gerar o hormônio melatonina (MEL), respectivamente e outros metabólitos biologicamente ativos. Outra via menos estudada, a via das aminas traço, produz produtos neuroativos. Dada a abrangência e importância das rotas metabólicas do Trp, nós desenvolvemos e validamos uma metodologia bioanalítica robusta, seletiva e sensível por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), acoplado espectrometria de massas (MS) para a determinação simultânea do Trp e seus 15 metabólitos. Para tanto, escolhemos para a avaliação das três vias, linhagens de glioma humano. A escolha por este tipo celular deveu-se ao grande interesse de estudos de metabolismo de Trp em células tumorais, no qual células de glioma tem sido modelo. Nos ensaios com as células de glioma acompanhamos os efeitos de um indutor e inibidores da primeira etapa de metabolização do Trp pela via das quinureninas, ou seja, IFN-γ (indutor da IDO), 1-metiltriptofano (1-MT; inibidor competitivo da IDO) e 680C91 (inibidor seletivo da TDO). Pudemos observar o impacto que a indução ou a inibição do primeiro passo teve sobre os metabólitos subsequentes e as diferenças no metabolismo das duas linhagens estudadas, A172 e T98G. A linhagem T98G só tem atividade de IDO, enquanto que a A172 tem tanto atividade IDO quanto TDO. A indução por IFN-γ mostrou que essa citocina não só atua na formação da via QUIN, mas possui um impacto modesto nas demais rotas. Observamos também que a inibição do 1-MT mostrou seu impacto nos metabólitos invdividualmente, do que a simples relação Trp-QUIN. Contudo, nosso resultados nos permitiu mostrar pela primeira vez a descrição completa dessas vias, em especial nessas linhagens celulares, podendo supor estratégias terapêuticas nessas rotas que estão relacionadas a progressão ou não tumoral.

Variabilidade intratípica de HPV 16 em relação à origem étnica e HLA de uma população de alto risco para o câncer do colo do útero

A infecção por papilomavirus é a principal causa de desenvolvimento de neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC) e câncer do colo do útero (CCU). Estudos epidemiológicos têm demonstrado que a persistência do genoma viral encontra-se associado a variantes moleculares específicas de papilomavirus humano (HPV) de alto risco. As moléculas HLA de classe II têm um importante papel na resposta imune. Associações entre HLA e CCU ou infecção por HPV tem sido demonstrado em diferentes populações. O nosso objetivo foi verificar se a variabilidade de HLA-DRB1 e DQB1 estavam associada ao CCU e NIC III em mulheres de Belém, uma população formada pelos 3 principais grupos étnicos humanos e uma área de alto risco para o CCU no Norte do Brasil. Foi investigada a existência de diferenças na distribuição de alelos HLA entre mulheres com CCU e NIC III portadoras de diferentes variantes de HPV-16 e mulheres citologicamente normais. Os genes HLA DQB1 e DRB1 foram tipados pelo método de PCR-SSO em 95 casos e 287 controles de mulheres com citologia normal atendidas em um centro de prevenção do colo do útero na mesma cidade. As variantes de HPV-16 foram tipadas por sequenciamento de um fragmento da região controladora do genoma viral (LCR). O polimorfismo na posição 350 do gene E6 foi tipado baseado em um protocolo de hibridização em pontos, para identificar a alteração na posição 350T→G. A magnitude das associações foi estimada por odds ratio (OR) e os respectivos intervalos de confiança (IC), ajustados para potenciais fatores de confusão. Uma associação positiva foi observada entre CCU e os haplótipos DRB1* 150 l-DQB1*0602, DRB1*04-DQB1*0301 e DRB1*1602-DQB1*0301. Ao contrário, DRB1*01-DQB1*0501 mostrou um efeito protetor. Os alelos DRB1*0804, DQB1*0402 apresentaram efeito protetor contra positividade por HPV. O alelo DQB1*0502 e o grupo DRB1*15 foram positivamente associados. Os nossos resultados mostram que as associações positivas de DRB1*1501 e DRB1*1602 podem ser atribuídas a variantes asiático-americanas quando comparado a variantes européias. O risco conferido a DRB1*1501 foi encontrado associado tanto a variantes E6350G quanto a variantes E6350T, entretanto, o maior efeito foi devido às variantes E6250T. A associação positiva de DRB1*1602 foi significativa somente no grupo de mulheres positivas para E6350G. Estes resultados estão de acordo com a composição étnica da população estudada bem como um maior potencial oncogênico de certas variantes. Nossos dados sugerem que a contribuição dos alelos HLA na susceptibilidade genética ao CCU difere de acordo com a distribuição das variantes de HPV em uma dada região geográfica ou grupo étnico.