Doseamento microbiológico de neomicina e bacitracina - desenvolvimento e validação de método rápido em microplacas

Os ensaios microbiológicos são utilizados para avaliar a atividade antimicrobiana desde a descoberta do uso dos antibióticos. Apesar dos ensaios microbiológicos serem amplamente empregados para determinação da potência de antibióticos em formas farmacêuticas, uma vez que fornecem a medida da atividade biológica, apresentam limitações quanto a baixa reprodutibilidade e tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, otimizar e validar ensaio colorimétrico rápido em microplaca para determinar a potência da neomicina e bacitracina em produtos farmacêuticos. Metodologias de análise fatorial e análise de superfície de resposta foram utilizadas no desenvolvimento e otimização da escolha do microrganismo, da composição do meio de cultura, da proporção de inóculo, e das concentrações de cloreto de trifeniltetrazólio e dos antibióticos. Os métodos otimizados foram validados pela avaliação da linearidade, precisão, exatidão e robustez. Análise estatística mostrou equivalência entre o método de difusão em ágar e o método colorimétrico rápido em microplaca para ambos antibióticos. Além disso, o ensaio em microplaca apresentou vantagens em relação à reprodutibilidade, sensibilidade, tempo de incubação e quantidades necessárias de meio de cultura e soluções para ambos os antibióticos.

Clonagem molecular, expressão, purificação e caracterização estrutural da endoglucanase de Trichoderma harzianum visando o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos para a produção de etanol lignocelulósico

O aumento na demanda mundial por energia, a perspectiva de encolhimento dos recursos energéticos e a preocupação global com a questão ambiental, despertaram o interesse por fontes alternativas de energia. A biomassa lignocelulósica é abundante e de baixo custo, com potencial para complementar a produção em larga escala de combustíveis. A degradação das moléculas constituintes da parede celular à açúcares fermentescíveis e então à etanol, ocorre através da hidrólise enzimática da biomassa. Contudo, a utilização de enzimas para esse fim encontra-se em estágio exploratório e representa um gargalo na implementação de tecnologias de etanol 2G em escala industrial, desencadeando a busca de celulases bioquimicamente mais ativas, estáveis e economicamente viáveis. O presente trabalho visou a caracterização da endoglucanase I do fungo Trichoderma harzianum, e para isso foi realizada expressão, ensaios bioquímicos e biofísicos do domínio catalítico (ThCel7B-CCD) e da proteína inteira (ThCel7B-full). A enzima exibiu um perfil acidofílico, com atividade ótima em pH 3,0 a 55°C. A proteína também se mostrou capaz de hidrolisar uma variedade de substratos, sendo a maior atividade hidrolítica em β-glucano (75 U mg-1). Ao analisar a estabilidade térmica medida a 55°C em pH 5, a atividade residual manteve-se intacta por mais de 2 meses. Outra característica relevante foi o elevado grau de sinergismo entre ThCel7B e ThCel7A. Análises de microscopia eletrônica de flocos de aveia submetidas à hidrólise com ThCel7B evidenciaram os efeitos de degradação do substrato em relação às amostras controle. O conjunto desses resultados, além de importante para a compreensão do mecanismo molecular de ThCel7B e de outras endoglucanases da família GH7, também revelou uma enzima de interesse biotecnológicos uma vez que o comportamento ácido e sua estabilidade térmica são características relevantes para aplicações industriais sob condições extremamente ácidas.