Investigação do papel de SIGIRR/IL-1R8 no crosstalk entre células tumorais e o infiltrado leucocitário

Células tumorais desenvolvem diversas estratégias para escapar da identificação e eliminação pelo sistema imune. Dessa forma, a investigação dos mecanismos envolvidos na comunicação celular no microambiente tumoral e na desregulação local do sistema imune é crítica para uma melhor compreensão da progressão da doença e para o desenvolvimento de alternativas terapêuticas mais eficazes. Nós aqui demonstramos que SIGIRR/IL-1R8, um importante regulador negativo de receptores de Interleucina-1 (ILRs) e receptores do tipo Toll (TLRs), apresenta expressão aumentada em uma linhagem celular epitelial mamária transformada pela superexpressão do oncogene HER2 e em tumores primários de mama, e promove o crescimento tumoral e metástase através da modulação da inflamação associada ao câncer e da atenuação da resposta imune antitumoral. Observamos que IL-1R8 tem sua expressão correlacionada com HER2 em tecidos mamários e sua alta expressão é fator de pior prognóstico em câncer de mama de baixo grau. Notavelmente, níveis aumentados de IL-1R8 foram observados especialmente nos subtipos HER2+ e Luminais de tumores de mama, e sua expressão aumentada em células epiteliais de mama transformadas por HER2 diminui a ativação da via de NF-κB e a expressão de diferentes citocinas pro-inflamatórias (IL-6, IL-8, TNF, CSF2, CSF3 e IFN-β1). Meio condicionado de células transformadas por HER2, mas não de variantes celulares com o gene IL-1R8 silenciado, induz a polarização de macrófagos para o fenótipo M2 e inibe a ativação de células NK. Em um modelo murino transgênico de tumorigênese espontânea mediada por HER2, MMTV-neu, verificamos que a deficiência de IL-1R8 (IL-1R8-/-neu) retardou o aparecimento de tumores e reduziu a incidência, a carga tumoral e a disseminação metastática. Contudo, não foram observadas diferenças significativas no crescimento tumoral quando animais IL-1R8-/-neu receberam medula óssea de animais IL-1R8+/+, confirmando um papel importante da expressão de IL-1R8 em células não hematopoiéticas na tumorigênese da mama. Tumores IL-1R8+/+neu apresentaram maiores níveis de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β e VEGF, e menores níveis da citocina imunomodulatória IFN-γ. Além disso, tumores que expressavam IL-1R8 apresentaram menor infiltrado de células NK maduras, células dendríticas (DCs) e linfócitos T-CD8+ e um maior infiltrado de macrófagos M2 e linfócitos T-CD4+. Coletivamente, esses resultados indicam que a expressão de IL-1R8 em tumores de mama pode representar um novo mecanismo de escape da resposta imune e suportam IL-1R8 como potencial alvo terapêutico.

Influência da deficiência ou suplementação com selênio durante o período gestacional de ratas na suscetibilidade da progênie feminina à carcinogênese mamária

Fatores dietéticos como o selênio (Se) são apontados como importantes moduladores do risco de desenvolvimento do câncer de mama. Essa neoplasia pode apresentar sua origem no início do desenvolvimento e, assim, a alimentação materna poderia ter importantes repercussões na programação fetal da doença. A fim de verificar se diferentes concentração de selênio na dieta materna poderiam programar o risco da progênie feminina ao câncer de mama, ratas foram alimentadas com ração contendo 0,15 (CO), 1,0 (SUP) ou 0,05 (DEF) ppm de Se durante a gestação e sua progênie feminina iniciada com DMBA. A progênie do grupo SUP apresentou menor suscetibilidade à carcinogênese, indicado pelo menor número médio e multiplicidade de adenocarcinomas mamários (p< 0,05), enquanto a do grupo DEF apresentou maior suscetibilidade à carcinogênese, indicado pela maior incidência dos mesmos (p< 0,05). Mães do grupo DEF apresentaram menor concentração de Se no sangue (p< 0,05) e sua prole apresentou menor atividade da enzima GPx1 (p< 0,05). Além disso, observou-se na glândula mamária da progênie de 50 dias menor expressão (western blot e qPCR) de ERα, Her-2, EGFR e Ras no grupo SUP em comparação aos grupos CO e DEF (p< 0,05). Analisou-se, ainda, o padrão de metilação global do DNA (HPLC-DAD), expressão das enzimas DNMT1, 3a e 3b (qPCR), o padrão global de modificações pós traducionais em histonas (western blot) e o padrão de metilação da região promotora do gene Erα (modificação com bissulfito e pirossequenciamento) na glândula mamária da progênie de 50 dias. Não houve diferença no padrão de metilação global do DNA e expressão das enzimas DNMTs (p>0,05). Houve aumento na expressão de H4K16 acetilada nos grupos SUP e DEF (p< 0,05). Finalmente, em comparação a progênie do grupo DEF, a do grupo SUP apresentou região promotora de Erα com aumento marginal (p=0,07) na metilação de dois dinucleotídeos CpG. Conclui-se que o consumo de diferentes concentrações de Se na dieta materna tem impacto sobre a suscetibilidade da progênie ao câncer de mama na vida adulta através da modulação da expressão de receptores e oncogenes relacionados ao desenvolvimeto dessa neoplasia, além da influência em processos epigenéticos. Tais resultados apontam para a existência de uma \"janela de programação\" no início do desenvolvimento sensível a ação do Se, resultando em diminuição do risco de câncer de mama quando suplementado na dieta materna e o inverso quando de sua deficiencia.

Efeitos do consumo materno e/ou paterno de extrato de amora-preta (Rubus spp.) na suscetibilidade da prole feminina à carcinogênese mamária quimicamente induzida

O câncer de mama é o segundo tipo de neoplasia mais prevalente no mundo e o mais comum entre as mulheres. É descrito que o padrão de consumo alimentar materno e paterno está relacionado à suscetibilidade da prole ao desenvolvimento de doenças crônicas não transmissíveis, inclusive o câncer. A amora-preta é uma das frutas com maior conteúdo antioxidante e seus compostos bioativos possuem atividade antioxidante, anticarcinogênica e anti-inflamatória. Sendo assim, o presente trabalho propõe avaliar os efeitos do consumo materno e/ou paterno de extrato de amora-preta (Rubus spp.) na suscetibilidade da prole feminina ao desenvolvimento de neoplasias mamárias quimicamente induzidas. Para tanto, camundongos da linhagem C57BL/6 foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: pai amora (PA), mãe amora (MA), pai e mãe amora (PMA) e controle (CTRL). Os pais receberam extrato de amora-preta logo após o desmame durante 8 semanas e as mães receberam o extrato durante a gestação e lactação. O extrato de amora-preta foi administrado na água de beber (0.84g de antocianinas/L) ad libitum. Os pais tratados com extrato de amora apresentaram redução na atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD) e da catalase (CAT) no testículo (p<0.05 e p<0.001, respectivamente), aumento na capacidade antioxidante plasmática, na porcentagem de espermatozoides normais e na produção diária de espermatozóides em relação ao grupo controle (p<0.001 para todos). Além disso, os grupos PA, MA e PMA apresentaram aumento na taxa de prenhez (p<0.05) e redução da mortalidade perinatal (p<0.01, p<0.05 e p<0.001, respectivamente). Em relação à prole feminina não submetida à carcinogênese foi observada redução na capacidade antioxidante plasmática nos grupos PA (p<0.001) e MA (p<0.01), enquanto o grupo PMA apresentou aumento nesse parâmetro (p<0.001). No desenvolvimento da glândula mamária, houve aumento do desenvolvimento epitelial nos grupos PA, MA e PMA (p<0.001 para todos), de diferenciação nos grupos MA e PMA (p<0.01 para ambos) e da taxa de apoptose nos grupos MA e PMA (p<0.05), além de redução no número de TEBs nos grupos PA, MA e PMA (p<0.01, p<0.001 e p<0.001, respectivamente). Não foram observadas alterações significativas nas filhas submetidas à indução química da carcinogênese mamária por DMBA. Assim, é possível concluir que apesar de ter alterado o desenvolvimento da glândula mamária, o consumo materno e/ou paterno de extrato de amora-preta não foi capaz de impactar sobre a suscetibilidade da prole feminina à carcinogênese mamária quimicamente induzida.

Análise comparativa de enxertos de gordura em refinamentos de reconstrução mamária com e sem suplementação de células-tronco

INTRODUÇÃO: Os enxertos de gordura tem se mostrado como uma poderosa técnica cirúrgica em reconstrução mamaria secundária e os enxertos enriquecidos com células-tronco, além de suas ações parácrinas, vem apresentando resultados encorajadores no que tange a persistência volumétrica. OBJETIVO: Este estudo clínico teve como objetivo analisar comparativamente quantitativa e qualitativamente enxertos de gordura enriquecidos com células da fração vásculoestromal em reconstrução mamária secundária e a incidência de complicações. MÉTODO: Nós desenvolvemos um método que produz enxertos de gordura, na sala de cirurgia, em uma taxa de enriquecimento maior que os já publicados (2:1). Este estudo clínico prospectivo e controlado analisou qualitativa e quantitativamente enxertos de gordura com (GT - grupo tronco) e sem (GC - grupo controle) adição das células da fração vásculo-estromal fresca em reconstrução mamária secundária; através de volumetria mamária por RNM de mamas, imunofenotipagem e contagem celular. Também foram estudados os resultados estéticos, a satisfação das pacientes e as complicações. RESULTADOS: A persistência volumétrica no GT foi 78,9% e 51,4% no GC, entretanto não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos. CD90 foi o marcador mais expresso e que alcançou diferença significante e ao mesmo tempo apresentou correlação positiva entre a sua expressão e a persistência volumétrica (r=0.651, p=0.03). Necrose gordurosa ocorreu, isoladamente em 4 pacientes do GT submetidas à radioterapia e nenhuma paciente do GC apresentou este evento. Desta forma, pacientes do GC mostraram tendência de estar mais satisfeitas com o enxerto de gordura. Nos dois grupos, os resultados estéticos foram iguais e não foram observadas recidivas loco-regionais. CONCLUSÃO: Os resultados do enriquecimento em uma taxa maior que as já publicadas são encorajadores, apesar de a persistência volumétrica não ter alcançado diferença estatisticamente significante entre os grupos. Enxertos de gordura enriquecidos na proporção 2:1 podem não ser indicados para pacientes submetidas à radioterapia apesar de terem se mostrados seguros num tempo de seguimento de 3 anos

Expressão de metaloproteinases de matriz (MMPS) e de seus inibidores (TIMPS e RECK) em modelo de progressão tumoral de Câncer de mama e sua correlação com dados clínicos-patológicos

O câncer de mama é o tipo de câncer mais comumente detectado em mulheres de todo o mundo. Na maioria das pacientes, a causa de morte se deve, principalmente, à doença metastática que pode se desenvolver a partir do tumor primário. O processo metastático envolve uma complexa cascata de eventos, incluindo a quebra organizada dos componentes da matriz extracelular por metaloproteinases de matriz (MMPs). A atividade das MMPs é precisamente regulada por inibidores específicos, os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs). Dado seu papel na progressão tumoral, níveis elevados de MMPs têm sido associados com prognóstico desfavorável para pacientes com câncer. Por outro lado, sendo os TIMPs proteínas multifuncionais, níveis elevados de TlMP-1 e de TIMP-2 correlacionam com agressividade do tumor e prognóstico ruim em diferentes tipos de câncer, incluindo o câncer de mama. O gene supressor de metástase RECK codifica uma glicoproteína de membrana capaz de inibir a invasão e a metástase tumoral através da regulação negativa da atividade de MMPs envolvidas em carcinogênese: MMP-2, MMP-9 e MMP-14 (MT1-MMP). A fim de analisar o papel das MMPs e de seus inibidores (TIMPs e RECK) na progressão tumoral do câncer de mama, o perfil de expressão destes genes foi detectado, através de ensaios de Real-Time PCR, em um painel de cinco linhagens celulares de carcinoma de mama humano com diferentes potenciais invasivos e metastáticos e em 72 amostras teciduais de tumores primários de mama e 30 amostras teciduais de borda normal adjacente ao tumor. O perfil de expressão protéica de RECK foi avaliado em 236 amostras de tumores primários de mama através de ensaios de Tissue Microarray. Além disso, a atividade proteolítica das MMPs foi detectada em ensaios de Zimografia. Os resultados obtidos indicam que a progressão do câncer de mama humano está relacionada com um aumento dos níveis de expressão das MMPs e de seus inibidores específicos. O aumento dos níveis de expressão dos TIMPs parece estar relacionado ao seu papel como proteína multifuncional que pode estar funcionando de maneira a promover, mais do que suprimir, a progressão tumoral. Níveis elevados da expressão protéica de RECK estão associados com pior prognóstico. No entanto, para pacientes em estádios clínicos avançados, altos níveis de expressão de RECK podem estar correlacionados com melhor prognóstico, dependendo do balanço MMP/inibidor. Os níveis de expressão das MMPs apresentaram correlação positiva em relação aos níveis de expressão de seus inibidores específicos, sugerindo a existência de fatores e vias de sinalização comuns envolvidas na regulação coordenada destes genes. Além disso, a síntese do inibidor pode estar relacionada a uma resposta celular ao aumento da expressão e atividade de proteases. O balanço transcricional enzima/inibidor favorece a enzima nas amostras tumorais e, de modo contrário, o inibidor específico nas amostras de borda normal, sugerindo o balanço como o principal fator na determinação da degradação da MEC em processos invasivos e metastáticos. Os resultados obtidos podem contribuir para um melhor entendimento da complexidade dos mecanismos envolvidos na metástase do câncer de mama.

Avaliação na linhagem endotelial tEnd dos efeitos diretos da transferência gênica de IFNbeta e p19arf e efeitos parácrinos mediados pela linhagem B16 transduzida pelos mesmos vetores adenovirais

A vascularização tem um papel central na progressão tumoral e representa um alvo terapêutico de grande interesse. A inibição da angiogênese tem potencial de retardar a progressão tumoral e inibir metástase. Em decorrência disto, terapias anti-angiogênicas têm demonstrado ser promissora no controle do crescimento tumoral. Segundo a literatura, interferon-? (IFN?, ativador do sistema imune inato e adaptativo) e p19Arf (supressor de tumor e parceiro funcional de p53), quando estudados individualmente, alteram a vasculatura tumoral. Nosso grupo construiu e utilizou vetores adenovirais recombinantes portadores dos cDNAs de INFbeta e p19Arf e observou que a transferência desta combinação de genes induziu morte celular e diminuiu progressão tumoral, resultados foram observados em modelos murinos de melanoma B16 de terapia genica in situ, vacina profilática e vacina terapêutica. Neste trabalho, exploramos a ideia que a combinação dos vetores adenovirais portadores de INFbeta e p19Arf proporcionam efeitos anti-angiogênicos através de seu impacto em células endoteliais. Para averiguarmos essa hipótese, células endoteliais murinas (tEnd) foram transduzidas com os vetores adenovirais, revelando que o vetor Ad-p19 confere inibição da proliferação, formação de tubos, migração e induz aumento na expressão de genes relacionados a via de p53 e morte celular. O vetor Ad-IFNbeta sozinho ou adicionado em combinação com Ad-p19, não teve impacto significante nestes ensaios. Alternativamente, a influencia indireta, ou parácrina, nas células tEnd cultivadas juntamente com as células B16 transduzidas com os vetores adenovirais também foi investigada. Quando as células B16 foram transduzidas com Ad-IFNbeta ou a co-transdução Ad-IFNbeta+Ad-p19 em co-cultura com a linhagem tEnd, houve inibição da proliferação. Não observamos efeito inibitório na tEnd da co-cultura quando as células da B16 foram transduzidas somente com Ad-p19. Seguindo o ensaio de co-cultura, produzimos meio condicionado da B16 transduzida com os vetores e aplicamos esses meios nas células tEnd. Observamos que Ad-IFN, sozinho ou em combinação com Ad-19, diminuiu a viabilidade, proliferação e levou a morte das células tEnd. Neste trabalho, constamos que inibição de células endoteliais pode ser realizada por transdução direta com Ad-19 ou quando estas células são expostas ao ambiente modulado por células tumorais transduzidas com o vetor Ad-IFNbeta. Mesmo que a transferência gênica de ambos IFNbeta e p19Arf não demonstrou ser uma abordagem superior à aplicação dos genes isolados, observamos que nossa abordagem pode ter um impacto importante na inibição da angiogênese pelas células endoteliais

Interações moleculares no mecanismo de ação da galectina-4 humana

A galectina-4 humana (HGal-4), pertencente à família das galectinas, possui dois domínios de reconhecimento de carboidratos (CRDs) com alta afinidade para β-galactosídeos e se encontra amplamente distribuída em células normais e neoplásicas de diferentes organismos. Suas funções snglobam uma grande variedade de eventos celulares, tais como processos inflamatórios, neoplásicos, progressão tumoral e metástase. Entretanto, muitas perguntas sobre suas interações com diferentes carboidratos, a especificidade destas interações e o papel específico das galectinas permanecem ainda sem resposta. No presente trabalho, propomos a investigação das interações galectina-glicano da galectina-4 humana e de seus domínios CRDs independentes (CRD-I e CRD-II) através de um conjunto de métodos biofísicos. Através do método de dicroísmo circular (CD), usando várias regiões espectrais, e fluorescência fomos capazes de entender mudanças ocorrentes na estrutura secundária e terciária das protéinas quando da interação com lactose/sacarose. Estes dados, juntamente com testes de hemaglutinação, mostraram que a glectina-4 e os CRDs respondem de forma distinta à ligação com açúcar. Por diferentes técnicas (fluorescência, ITC e MST) determinamos as constantes de dissociação para os domínios CRDs (Kd ~0,5 mM) e para HGal-4 e, de forma qualitativa, os valores obtidos indicaram possíveis estados oligoméricos dessas proteínas. A investigação da interação proteína-membrana da HGal-4 foi feita, primeiramente, com miméticos de membranas e monitorada pela técnica de RPE em crescente complexidade de composição de tais miméticos, indo desde composições mais simples, passando por lipid rafts na presença de diferentes glicolipídeos (GM1, LPS) e chegando-se à interação com células tumorais (U87MG, T98G e HT-29). Tais experimentos mostraram que galectina-4 reconhece e se liga naqueles modelos onde existem glicanos complexos na superfície. Investigamos também a participação de HGal-4 endógena e exógena no tratamento quimioterápico de células tumorais e verificamos um papel importante de HGal-4 para células HT-29. Finalizando esta tese, apresentamos o trabalho realizado em um ano de estágio na University of Oxford, durante o qual, investigamos a estrutura da região C-terminal de um receptor da família GPCR, qual seja o receptor de neurotensina NTS1. Aqui, mais uma vez, foi empregada a técnica de RPE que aliada à produção/marcação de mutantes do receptor, permitiu determinar que a hélice H8 se estabiliza quando em proteolipossomos.

Caracterização do envolvimento do gene RECKna proliferação celular e progressão tumoral: inversa correlação com a expressão do oncogene c-myc

Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral.