Efeito da estimulação purinérgica sobre a produção de melatonina em macrófagos da linhagem RAW 264.7

A melatonina é um hormônio produzido de forma rítmica e no período de escuro pela glândula pineal bem como de forma não rítmica por diversos tecidos e células imunocompetentes. É sintetizada pela acetilação e metilação da serotonina pela ação das enzimas arilalquilamina N-acetiltransferase (AA-NAT) e acetilserotonina -O-metiltransferase (ASMT) que levam à formação de N-acetilserotonina (NAS) e melatonina (MEL), respectivamente. Nos últimos anos temos demonstrado que síntese de melatonina pela pineal pode ser negativamente modulada por mediadores inflamatórios e pelo ATP que atua como co-transmissor juntamente com a noradrenalina liberada no terminal nervoso simpático que a inerva. Perifericamente, contudo, estes mediadores inflamatórios apresentam um efeito contrário induzindo a produção de melatonina em células imunocompetentes. Estas observações levaram à criação da hipótese de um eixo imune-pineal. Esse trabalho teve como objetivo verificar o efeito do ATP sobre produção de melatonina em macrófagos da linhagem RAW 264.7 Os dados desse trabalho mostram que o ATP é capaz de induzir de maneira dose dependente a produção de melatonina em macrófagos através da modulação das enzimas AA-NAT e ASMT. Foi demostrado também que esse efeito é mediado pelo receptor P2X7 e que a melatonina produzida age autocrina e paracrinamente aumentando a fagocitose de particulas de zimosan. Com isso, podemos concluir que o ATP é um ativador endógeno do eixo imune-pineal

Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para o monitoramento dos produtos das vias metabólicas do triptofano em linhagem celular de glioma humano

O metabolismo do triptofano (Trp) se dá pela via das quinureninas (QUIN), pela via serotoninérgica (SER) e pela via das aminas traço. A primeira gera QUIN e uma variedade de outros metabólitos secundários. Quando conduzida pela enzima indolamina 2,3 dioxigenase (IDO) contribui para os fenômenos de tolerância e imune escape de células tumorais; e quando conduzida pela triptofano 2,3 dioxigenase (TDO) no fígado, participa na síntese da niacina e NAD. A via SER leva à formação do neurotransmissor serotonina (SER), que pode gerar o hormônio melatonina (MEL), respectivamente e outros metabólitos biologicamente ativos. Outra via menos estudada, a via das aminas traço, produz produtos neuroativos. Dada a abrangência e importância das rotas metabólicas do Trp, nós desenvolvemos e validamos uma metodologia bioanalítica robusta, seletiva e sensível por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), acoplado espectrometria de massas (MS) para a determinação simultânea do Trp e seus 15 metabólitos. Para tanto, escolhemos para a avaliação das três vias, linhagens de glioma humano. A escolha por este tipo celular deveu-se ao grande interesse de estudos de metabolismo de Trp em células tumorais, no qual células de glioma tem sido modelo. Nos ensaios com as células de glioma acompanhamos os efeitos de um indutor e inibidores da primeira etapa de metabolização do Trp pela via das quinureninas, ou seja, IFN-γ (indutor da IDO), 1-metiltriptofano (1-MT; inibidor competitivo da IDO) e 680C91 (inibidor seletivo da TDO). Pudemos observar o impacto que a indução ou a inibição do primeiro passo teve sobre os metabólitos subsequentes e as diferenças no metabolismo das duas linhagens estudadas, A172 e T98G. A linhagem T98G só tem atividade de IDO, enquanto que a A172 tem tanto atividade IDO quanto TDO. A indução por IFN-γ mostrou que essa citocina não só atua na formação da via QUIN, mas possui um impacto modesto nas demais rotas. Observamos também que a inibição do 1-MT mostrou seu impacto nos metabólitos invdividualmente, do que a simples relação Trp-QUIN. Contudo, nosso resultados nos permitiu mostrar pela primeira vez a descrição completa dessas vias, em especial nessas linhagens celulares, podendo supor estratégias terapêuticas nessas rotas que estão relacionadas a progressão ou não tumoral.

Efeitos de dois modelos experimentais de dietas hipercalóricas sobre parâmetros comportamentais e biológicos em ratos da linhagem Wistar

O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos de dois modelos experimentais de dietas hipercalóricas em comportamentos de ansiedade, processos de aprendizagem e memória e alterações metabólicas. Os animais foram divididos em seis grupos experimentais, de acordo com a condição nutricional. 1) Controle (C); 2) Dieta de Cafeteria (DC); 3) Dieta Hiperlipídica (DH); 4) Controle AIN-93 (C/AIN-93); 5) Dieta de Cafeteria AIN-93 (DC/AIN-93), e 6) Dieta Hiperlipídica AIN-93 (DH/AIN-93). Posteriormente, os grupos foram subdivididos em dois grupos independentes, conforme a tarefa à qual foram submetidos. Pesagens foram realizadas semanalmente até os 98 dias de vida; foram verificados os pesos do fígado, do coração e o peso de tecido adiposo retroperitoneal e epididimal e foram realizadas dosagens de glicose, triglicérides, TGO e TGP no soro e gordura total, colesterol total e triglicérides no fígado. Os testes utilizados: Labirinto em T Elevado (LTE), Caixa Claro/Escuro e Labirinto Aquático de Morris (LAM). Os resultados de peso corporal, os dados comportamentais do LAM, do LTE e os dados de peso dos tecidos extraídos no dia do sacrifício e as análises bioquímicas foram submetidos a uma Análise de Variância (ANOVA). Quando apropriado, foi utilizado o teste de comparações múltiplas de Newman-Keuls (p< 0,05). Os dados comportamentais do teste claro/escuro foram submetidos ao teste t-Student (p< 0,05). Animais tratados com dieta hiperlipídica apresentaram maiores medidas de peso e ganho de peso comparados aos animais controle e dieta de cafeteria, tratados com pellet e com dieta AIN-93. Animais DH1, DC1, DH1 AIN-93, DH2 AIN-93 e DH2 apresentaram maior peso no dia do sacrifício. Animais DH1, DH1 AIN-93, DH2 e DH2 AIN-93 apresentaram maior acúmulo dos tecidos adiposos retroperitoneal e epididimal. Animais DH1 AIN-93 e DC2 AIN-93 apresentaram maiores níveis de glicose. Animais C2, DH2 e DC2 apresentaram maiores níveis de triglicérides. Animais DH1 e C1 apresentaram menores valores de TGO. Animais C2 e C2 AIN-93 apresentaram maiores níveis de TGO. Animais C1, DH1, C2 e DH2 apresentaram maiores níveis de TGP. Animais DH1 AIN-93, DH1, DH2 e DH2 AIN-93 apresentaram maiores valores de gordura total no fígado. Animais DH1 AIN-93 e DH2 apresentaram maiores níveis de colesterol no fígado. Animais DH1, DC1, DH2 e DH2 AIN-93 apresentaram maiores níveis de triglicérides no fígado. Com relação ao consumo alimentar, animais DH apresentaram maior consumo calórico e maior consumo lipídico quando comparados aos animais C e DC, com ração em pellet ou dieta AIN-93. Com relação ao LTE, não foram verificadas diferenças nas esquivas e na fuga. Animais DC1, DH1 e DH1 AIN-93 apresentaram menores níveis de ansiedade verificados a partir dos dados do teste da caixa claro-escuro. Animais DC2 AIN-93 apresentaram pior desempenho em tarefa de memória. Os dados obtidos a partir deste estudo demonstraram que as dietas utilizadas foram capazes de acarretar ganho de peso, acúmulo de tecido adiposo, alterações metabólicas, diminuição da ansiedade nos animais e pior desempenho em uma tarefa de memória em um dos grupos nutricionais.

Avaliação na linhagem endotelial tEnd dos efeitos diretos da transferência gênica de IFNbeta e p19arf e efeitos parácrinos mediados pela linhagem B16 transduzida pelos mesmos vetores adenovirais

A vascularização tem um papel central na progressão tumoral e representa um alvo terapêutico de grande interesse. A inibição da angiogênese tem potencial de retardar a progressão tumoral e inibir metástase. Em decorrência disto, terapias anti-angiogênicas têm demonstrado ser promissora no controle do crescimento tumoral. Segundo a literatura, interferon-? (IFN?, ativador do sistema imune inato e adaptativo) e p19Arf (supressor de tumor e parceiro funcional de p53), quando estudados individualmente, alteram a vasculatura tumoral. Nosso grupo construiu e utilizou vetores adenovirais recombinantes portadores dos cDNAs de INFbeta e p19Arf e observou que a transferência desta combinação de genes induziu morte celular e diminuiu progressão tumoral, resultados foram observados em modelos murinos de melanoma B16 de terapia genica in situ, vacina profilática e vacina terapêutica. Neste trabalho, exploramos a ideia que a combinação dos vetores adenovirais portadores de INFbeta e p19Arf proporcionam efeitos anti-angiogênicos através de seu impacto em células endoteliais. Para averiguarmos essa hipótese, células endoteliais murinas (tEnd) foram transduzidas com os vetores adenovirais, revelando que o vetor Ad-p19 confere inibição da proliferação, formação de tubos, migração e induz aumento na expressão de genes relacionados a via de p53 e morte celular. O vetor Ad-IFNbeta sozinho ou adicionado em combinação com Ad-p19, não teve impacto significante nestes ensaios. Alternativamente, a influencia indireta, ou parácrina, nas células tEnd cultivadas juntamente com as células B16 transduzidas com os vetores adenovirais também foi investigada. Quando as células B16 foram transduzidas com Ad-IFNbeta ou a co-transdução Ad-IFNbeta+Ad-p19 em co-cultura com a linhagem tEnd, houve inibição da proliferação. Não observamos efeito inibitório na tEnd da co-cultura quando as células da B16 foram transduzidas somente com Ad-p19. Seguindo o ensaio de co-cultura, produzimos meio condicionado da B16 transduzida com os vetores e aplicamos esses meios nas células tEnd. Observamos que Ad-IFN, sozinho ou em combinação com Ad-19, diminuiu a viabilidade, proliferação e levou a morte das células tEnd. Neste trabalho, constamos que inibição de células endoteliais pode ser realizada por transdução direta com Ad-19 ou quando estas células são expostas ao ambiente modulado por células tumorais transduzidas com o vetor Ad-IFNbeta. Mesmo que a transferência gênica de ambos IFNbeta e p19Arf não demonstrou ser uma abordagem superior à aplicação dos genes isolados, observamos que nossa abordagem pode ter um impacto importante na inibição da angiogênese pelas células endoteliais

Estudos sobre a organização genômica, evolução e expressão de microRNAs

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores de proteínas presentes na maioria dos eucariotos. Esses RNAs regulam a expressão gênica em nível pós-transcricional através do silenciamento de mRNAs-alvo que possuem sítios complementares às suas sequências, atuando em praticamente todos os processos celulares. Embora a estrutura e função dos miRNAs estejam bem caracterizadas, aspectos relacionados à sua organização genômica, evolução e atuação em doenças são tópicos que apresentam enormes lacunas. Nesta tese, utilizamos abordagens computacionais para investigar estes temas em três trabalhos. No primeiro, processamos e integramos um vasto volume de dados publicamente disponíveis referentes aos miRNAs e genes codificadores de proteínas para cinco espécies de vertebrados. Com isso, construimos uma ferramenta web que permite a fácil inspeção da organização genômica dos miRNAs em regiões inter e intragênicas, o acesso a dados de expressão de miRNAs e de genes codificadores de proteínas (classificados em genes hospedeiros e não hospedeiros de miRNAs), além de outras informações pertinentes. Verificamos que a ferramenta tem sido amplamente utilizada pela comunidade científica e acreditamos que ela possa facilitar a geração de hipóteses associadas à regulação dos miRNAs, principalmente quando estão inseridos em genes hospedeiros. No segundo estudo, buscamos compreender como o contexto genômico e a origem evolutiva dos genes hospedeiros influenciam a expressão e evolução dos miRNAs humanos. Nossos achados mostraram que os miRNAs intragênicos surgem preferencialmente em genes antigos (origem anterior à divergência de vertebrados). Observamos que os miRNAs inseridos em genes antigos têm maior abrangência de expressão do que os inseridos em genes novos. Surpreendentemente, miRNAs jovens localizados em genes antigos são expressos em um maior número de tecidos do que os intergênicos de mesma idade, sugerindo uma vantagem adaptativa inicial que pode estar relacionada com o controle da expressão dos genes hospedeiros, e como consequência, expondo-os a contextos celulares e conjuntos de alvos diversos. Na evolução a longo prazo, vimos que genes antigos conferem maior restrição nos padrões de expressão (menor divergência de expressão) para miRNAs intragênicos, quando comparados aos intergênicos. Também mostramos possíveis associações funcionais relacionadas ao contexto genômico, tais como o enriquecimento da expressão de miRNAs intergênicos em testículo e dos intragênicos em tecidos neurais. Propomos que o contexto genômico e a idade dos genes hospedeiros são fatores-chave para a evolução e expressão dos miRNAs. Por fim, buscamos estabelecer associações entre a expressão diferencial de miRNAs e a quimioresistência em câncer colorretal utilizando linhagens celulares sensíveis e resistentes às drogas 5-Fluoruracil e Oxaliplatina. Dentre os miRNAs identificados, o miR-342 apresentou níveis elevados de expressão nas linhagens sensíveis à Oxaliplatina. Com base na análise dos alvos preditos, detectamos uma significativa associação de miR-342 com a apoptose. A superexpressão de miR-342 na linhagem resistente SW620 evidenciou alterações na expressão de genes da via apoptótica, notavelmente a diminuição da expressão do fator de crescimento PDGFB, um alvo predito possivelmente sujeito à regulação direta pelo miR-342.

Investigação do papel de SIGIRR/IL-1R8 no crosstalk entre células tumorais e o infiltrado leucocitário

Células tumorais desenvolvem diversas estratégias para escapar da identificação e eliminação pelo sistema imune. Dessa forma, a investigação dos mecanismos envolvidos na comunicação celular no microambiente tumoral e na desregulação local do sistema imune é crítica para uma melhor compreensão da progressão da doença e para o desenvolvimento de alternativas terapêuticas mais eficazes. Nós aqui demonstramos que SIGIRR/IL-1R8, um importante regulador negativo de receptores de Interleucina-1 (ILRs) e receptores do tipo Toll (TLRs), apresenta expressão aumentada em uma linhagem celular epitelial mamária transformada pela superexpressão do oncogene HER2 e em tumores primários de mama, e promove o crescimento tumoral e metástase através da modulação da inflamação associada ao câncer e da atenuação da resposta imune antitumoral. Observamos que IL-1R8 tem sua expressão correlacionada com HER2 em tecidos mamários e sua alta expressão é fator de pior prognóstico em câncer de mama de baixo grau. Notavelmente, níveis aumentados de IL-1R8 foram observados especialmente nos subtipos HER2+ e Luminais de tumores de mama, e sua expressão aumentada em células epiteliais de mama transformadas por HER2 diminui a ativação da via de NF-κB e a expressão de diferentes citocinas pro-inflamatórias (IL-6, IL-8, TNF, CSF2, CSF3 e IFN-β1). Meio condicionado de células transformadas por HER2, mas não de variantes celulares com o gene IL-1R8 silenciado, induz a polarização de macrófagos para o fenótipo M2 e inibe a ativação de células NK. Em um modelo murino transgênico de tumorigênese espontânea mediada por HER2, MMTV-neu, verificamos que a deficiência de IL-1R8 (IL-1R8-/-neu) retardou o aparecimento de tumores e reduziu a incidência, a carga tumoral e a disseminação metastática. Contudo, não foram observadas diferenças significativas no crescimento tumoral quando animais IL-1R8-/-neu receberam medula óssea de animais IL-1R8+/+, confirmando um papel importante da expressão de IL-1R8 em células não hematopoiéticas na tumorigênese da mama. Tumores IL-1R8+/+neu apresentaram maiores níveis de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β e VEGF, e menores níveis da citocina imunomodulatória IFN-γ. Além disso, tumores que expressavam IL-1R8 apresentaram menor infiltrado de células NK maduras, células dendríticas (DCs) e linfócitos T-CD8+ e um maior infiltrado de macrófagos M2 e linfócitos T-CD4+. Coletivamente, esses resultados indicam que a expressão de IL-1R8 em tumores de mama pode representar um novo mecanismo de escape da resposta imune e suportam IL-1R8 como potencial alvo terapêutico.

Efeito da desnutrição proteica sobre aspectos da mobilização, migração e sinalização celular. Papel da glutamina na modulação desses processos

A desnutrição é uma condição nutricional que pode afetar muitos aspectos da resposta imunológica, como alterações na migração celular, na fagocitose, na resposta bactericida, mudanças na produção de radicais livres e espécies de nitrogênio e na produção de citocinas pró-inflamatórias. Logo, indivíduos desnutridos apresentam maior susceptibilidade a infecções. Visto que a glutamina é um aminoácido de extrema importância para a funcionalidade de diversas células do sistema imune e que as mesmas apresentam aumento da utilização desse aminoácido durante processos infecciosos, investigou-se, neste trabalho, quais os efeitos da glutamina sobre alguns aspectos da mobilização, migração e sinalização celular em um modelo experimental de desnutrição proteica. Para tanto, utilizou-se camundongos da linhagem BALB/c machos, os quais foram divididos em dois grupos, Controle e Desnutrido, que passaram a receber dietas isocalóricas contendo 12% (normoproteica) e 2% de caseína (hipoproteica), respectivamente, durante 5 semanas. Para as avaliações in vivo, animais de ambos os grupos receberam por via endovenosa 100µL de solução contendo 1,25µg de LPS e após 1 hora 0,75mg/Kg de L-glutamina (GLUT). Após o período de desnutrição ou de indução ao processo inflamatório, os animais foram eutanasiados e as amostras biológicas coletas. Foram avaliados nos animais estimulados in vivo hemograma, mielograma, as citocinas IL-10 e TNF-α circulantes e a expressão de CD11b/CD18 nos granulócitos do sangue periférico. Foi avaliado, in vitro, a capacidade migratória, a expressão de CD11b/CD18 de polimorfonucleados da medula óssea e do sangue periférico, bem como a síntese de citocinas IL-1α, IL-6, IL-10, IL-12 e TNF-α e a expressão de NF-κB e IκBα em células cultivadas em meio com 0; 0,6; 2 e 10 mM de GLUT. Os animais desnutridos apresentaram anemia, leucopenia, hipoplasia medular e diminuição na concentração sérica de proteínas, albumina e pré-albumina. A GLUT, in vitro, apresentou capacidade de reduzir a produção de IL-1α e IL-6, bem como a ativação da via do NF-κB. No modelo in vivo a GLUT, em animais estimulados com LPS, alterou a cinética de migração neutrofílica e reduziu a expressão de CD18, bem como diminuiu os níveis de TNFα circulantes.

Efeitos da glutamina e taurina sobre a via de sinalização do NFκB em células Raw 264.7 estimuladas com LPS

O sistema imunológico preserva a integridade do organismo perante o ambiente que ele está inserido. As reações imunológicas são essenciais para controle e eliminação da infecção, no entanto se os mecanismos contra regulatórios da resposta imunológica forem superados, a homeostasia pode falhar levando a um desequilíbrio no processo de reparo do organismo, podendo causar danos, insuficiência de órgão e até a morte. Muitos estudos têm demonstrado a interação entre o sistema imunológico e os aminoácidos. Visto que a glutamina é utilizada como substrato energético para enterócitos, além de fornecer nitrogênio para síntese de purinas e pirimidinas para proliferação celular e a taurina participa da hemostasia, estabilização de membranas, mobilização de cálcio, além de ser importante agente antioxidante, nos propusemos nesse trabalho investigar os efeitos da glutamina e taurina sobre aspectos relacionados a resposta imunológica de células da linhagem Raw 264.7. Para tanto foram avaliadas: viabilidade celular; a capacidade proliferativa e o ciclo celular; a capacidade de síntese de citocinas: IL-1 α, IL-1β, IL-6, IL-10 e TNF-α e a expressão do fator de transcrição NFκB, bem como de seu inibidor IκBα. Foi possível observar aumento da viabilidade e proliferação celular para células tratadas com glutamina, entretanto não foi observado o mesmo efeito para taurina. Quando ambos aminoácidos foram associados, houve prevalência dos efeitos da glutamina. Observamos neste trabalho, que houve uma tendência da diminuição de expressão da relação de p-NFκB/NFκB quando se aumentou a concentração de glutamina. Paralelamente, o mesmo foi encontrado para relação p-IκB/IκB. Esses resultados corroboram com os resultados encontrados na produção das citocinas pró-inflamatórias IL-1α, Il-1β e TNF-α, uma vez que ao aumentarmos a concentração de glutamina bem como glutamina e taurina, observamos menor produção das mesmas. Complementarmente, encontramos resultados opostos para a citocina anti-inflamatória IL-10, a qual teve maior síntese em resposta ao aumento da concentração dos aminoácidos. Portanto concluímos que tanto a glutamina quanto a taurina possuem capacidade de modular aspectos da resposta imunológica de células Raw 264.7.

Efeitos da probabilidade e proporção de reforço sobre o comportamento de escolha em ratos Wistar (Rattus norvegicus)

A metacognição é processo conceituado como o julgamento que um organismo (humano ou não humano) faz sobre seu próprio saber ou não saber. Há relatos de pesquisas sobre esse processo com seres humanos e diversas espécies de não humanos. Poucos estudos, porém, discutem a ocorrência de metacognição em ratos, e os resultados são controversos, em função de questionamentos sobre os procedimentos experimentais empregados. Este estudo teve o objetivo de investigar o efeito da manipulação de diferentes proporções de reforço produzidas em duas alternativas, sendo uma probabilística e outra com reforçamento contínuo, sobre o desempenho de ratos em uma tarefa de discriminação de diferentes durações de estímulos sonoros. O procedimento empregado é uma adaptação do utilizado por Foote e Crystal (2007), que investigou a ocorrência de metacognição em ratos. Foram utilizados cinco ratos machos, da linhagem Wistar (Rattus norvegicus) mantidos a 80% de seu peso ad libitum. O aparato utilizado foi um labirinto em Ey. O procedimento consistiu de quatro fases: 1) Treino exploratório no braço em Y, no qual o animal foi exposto a alternativas que continham seis pelotas de ração; 2) Treino de discriminação de estímulos sonoros, no qual foram treinadas duas discriminações condicionais com duas durações de estímulo sonoro, uma curta (2s), e uma longa (8s), cada uma correlacionada com a escolha de uma das portas do braço em Y; 3) Treino exploratório no braço em I, no qual os animais foram expostos a uma alternativa livre, que continha três pelotas de ração; e 4) Fase de Teste, na qual foram apresentadas diferentes durações de som (2.00, 2.44, 2.97, 3.62, 4.42, 5.38, 6.56 e 8.00s), a partir das quais o animal poderia escolher entre o braço em Y (fazer o teste), e receber seis pelotas de ração caso escolhesse a porta correta (correlacionada à duração curta ou longa), ou escolher a alternativa de recusa do teste, produzindo, com certeza, a quantidade de ração estabelecida pela condição em vigor. Foi analisada a porcentagem de escolhas realizadas pelos animais nos braços Y e I em cada condição, assim como a relação entre a porcentagem de acertos e erros nos testes e recusa, para cada duração de som. Todos os sujeitos atingiram o critério de aprendizagem estabelecido na fase de treino. Na fase de testes, observou-se que o som deixou de exercer controle sobre a resposta de escolha de todos os animais. À medida que a proporção de reforço variou na alternativa de recusa, os animais alteraram o padrão de escolha, de propensão para aversão ao risco, de acordo com a condição em vigor. A escolha por uma alternativa não se mostrou sob controle da acurácia dos animais em discriminar as durações dos estímulos apresentados, mas sim da proporção e probabilidade do reforço em cada alternativa. Discute-se a necessidade de se recorrer ao conceito de metacognição para descrever o desempenho dos animais em tarefas como a empregada no presente estudo.

Diversificação de espécies e da morfologia em serpentes da família Viperidae: padrões e processos

A diversidade de espécies e fenotípica pode variar consideravelmente entre grupos taxonômicos e ao longo do tempo em uma mesma linhagem. O estudo de tais variações tornou-se um dos principais objetivos da biologia evolutiva fornecendo informações importantes a respeito dos possíveis mecanismos que regulam a biodiversidade. Dessa forma, o objetivo geral da presente tese foi investigar os padrões da diversificação de espécies e da morfologia em um grupo cosmopolita de serpentes, a família Viperidae, e os potenciais processos subjacentes. Primeiramente, (1) reconstruímos as relações filogenéticas e estimamos os tempos de divergência entre as linhagens da família Viperidae utilizando uma abordagem Bayesiana. (2) Aplicando um método recentemente desenvolvido (BAMM), exploramos como as taxas de especiação e extinção variaram ao longo da radiação do grupo inferindo os possíveis processos reguladores. Por fim, (3) analisamos se a evolução do tamanho do corpo e as taxas de especiação variam nos diferentes habitats ocupados pelos viperídeos (terrestres vs arborícola). Nesta tese geramos a filogenia molecular de viperídeos mais completa até o momento utilizando sequências para 11 genes mitocondriais e nucleares abrangendo 79% das espécies viventes (264 terminais) e todos com exceção de um gênero. De maneira geral, foi possível obter relações filogenéticas robustas para o grupo com a maioria dos gêneros sendo monofilética. Os tempos de divergência obtidos indicam que os viperídeos começaram a diversificar em meados do Paleoceno tardio/meio do Eoceno inferindo idades um pouco mais tardias que o encontrado em estudos anteriores. Durante a radiação do grupo, um aumento nas taxas de especiação parece ter ocorrido durante a diversificação dos crotalíneos (pit vipers) em decorrência não só da evolução das fossetas loreais mas também como resultado de mudanças geológicas e climáticas na Ásia e da invasão do novo mundo. Após este rápido aumento inicial, as taxas de especiação desaceleraram em direção ao presente. Por fim, os resultados aqui apresentados indicam que apesar dos habitats arborícolas limitarem a evolução morfológica nos viperídeos, a evolução da arborealidade parece não afetar as taxas de especiação que permanecem similares entre linhagens arborícolas e terrestres. Isto sugere dois cenários: (1) a especiação acontece de forma independente das mudanças morfológicas nos viperídeos; ou (2) o isolamento geográfico seria um mecanismo importante na diversificação de linhagens arborícolas contrabalançando decréscimos nas oportunidades de especiação possivelmente relacionados às pressões seletivas impostas pelo ambiente arborícola. A presente tese contribui para entendermos mais sobre como evoluíram os viperídeos ao longo dos seus ∼50 milhões de anos. Além de propor cenários e hipóteses a serem futuramente explorados com os viperídeos, elaboramos uma discussão ampla e conceitual a respeito dos possíveis mecanismos por trás da diversificação de espécies e da morfologia que poderiam também ser contemplados para outros grupos de organismos. Portanto, a presente tese contribui não só para entendermos os mecanismos que geram e mantém a diversidade de serpentes, mas também para enriquecer a discussão dos mecanismos que geram e mantém a biodiversidade como um todo

Dominância funcional e monitoramento da resistência de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) a tecnologias Bt no Brasil

Plantas transgênicas que expressam toxinas de Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) têm sido amplamente utilizadas para o controle de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) no Brasil. Entretanto, a evolução da resistência é um dos maiores entraves para a continuidade do uso desta tecnologia. Para subsidiar programas de Manejo da Resistência de Insetos (MRI), foram conduzidos estudos para o aprimoramento dos programas de manejo da resistência de S. frugiperda a tecnologias Bt. Foram realizadas estudos para determinar a dominância funcional da resistência de S. frugiperda a tecnologias Bt mediante a avaliação da sobrevivência de larvas neonatas provenientes das linhagens de S. frugiperda resistentes ao milho Herculex® que expressa a proteína Cry1F (HX-R), ao milho YieldGard VT PRO™ que expressa as proteínas Cry1A.105 e Cry2Ab2 (VT-R), ao milho PowerCore™ que expressa as proteínas Cry1A.105, Cry2Ab2 e Cry1F (PW-R), e ao milho Agrisure Viptera™ que expressa a proteína Vip3Aa20 (Vip-R), além da linhagem suscetível (Sus) e de suas respectivas linhagens heterozigotas em diversas tecnologias de milho e algodão Bt. Posteriormente, um método prático para o monitoramento fenotípico da suscetibilidade a diferentes tecnologias de milho e algodão Bt foi testado a partir da avaliação da sobrevivência de larvas neonatas em folhas de plantas Bt em populações de S. frugiperda provenientes dos Estados do Rio Grande do Sul, Paraná, São Paulo, Goiás e Bahia na safra agrícola 2014/15. E por último, a estimativa da frequência de alelos de resistência de S. frugiperda a Vip3Aa20 foi validada pelo método de F1 screen. Em geral, observou-se alta mortalidade dos heterozigotos nas tecnologias Bt testadas, comprovando que a resistência de S. frugiperda a proteínas Bt é funcionalmente recessiva o que suporta a estratégia de refúgio em programas de MRI. Verificou-se também que linhagens resistentes a eventos que expressam proteínas Cry não sobrevivem em tecnologias que expressam proteína Vip. No monitoramento prático da suscetibilidade a tecnologias Bt, sobrevivência larval superior a 70% foi observada para populações de campo do Paraná, Goiás e Bahia no milho Herculex®. Em tecnologias de milho PowerCore™ e YieldGard VT PRO™ houve sobrevivência larval variando de 1,1 a 17,9%. Em contraste, não houve sobreviventes em tecnologias de milho Viptera™. Em algodão WideStrike® que expressa as proteínas Cry1Ac e Cry1F, sobrevivência acima de 41% foi observada para populações de campo de S. frugiperda. A sobrevivência larval em Bollgard II® que expressa as proteínas Cry1Ac e Cry2Ab2 variou de 14 a 40%. No algodão TwinLink® que expressa as proteínas Cry1Ab e Cry2Ae, a sobrevivência larval das populações foi menor que 20%. O método de F1 screen foi eficiente na detecção de alelos de resistência a Vip3Aa20 em populações de S. frugiperda provenientes de diferentes regiões produtoras de milho no Brasil na safra 2014/2015. De 263 isofamílias testadas, foram detectadas três isofamílias positivas oriundas do Paraná, Mato Grosso e Goiás. A frequência de resistência estimada a Vip3Aa20 variou de 0,0140 a 0,0367 nas populações avaliadas, sendo que a frequência total foi de 0,0076. Neste estudo, fornecemos informações para refinar as estratégias de MRI, além de introduzir novas técnicas para monitorar a resistência de S. frugiperda a tecnologias Bt no Brasil.

Modelo numérico mecanobiológico para a obtenção da matriz de rigidez estrutural e da densidade mineral na remodelagem óssea

Neste trabalho é proposto um modelo mecanobiológico de remodelagem óssea para a estimativa de variações, provocadas por perturbações mecânicas ou biológicas, na matriz de rigidez estrutural da escala macroscópica e na densidade mineral em uma região do osso. Na cooperação entre as áreas da saúde e da engenharia, como nos estudos estruturais de biomecânica no sistema esquelético, as propriedades mecânicas dos materiais devem ser conhecidas, entretanto os ossos possuem uma constituição material altamente complexa, dinâmica e variante entre indivíduos. Sua dinâmica decorre dos ciclos de absorção e deposição de matriz óssea na remodelagem óssea, a qual ocorre para manter a integridade estrutural do esqueleto e adaptá-lo aos estímulos do ambiente, sejam eles biológicos, químicos ou mecânicos. Como a remodelagem óssea pode provocar alterações no material do osso, espera-se que suas propriedades mecânicas também sejam alteradas. Na literatura científica há modelos matemáticos que preveem a variação da matriz de rigidez estrutural a partir do estímulo mecânico, porém somente os modelos mais recentes incluíram explicitamente processos biológicos e químicos da remodelagem óssea. A densidade mineral óssea é um importante parâmetro utilizado no diagnóstico de doenças ósseas na área médica. Desse modo, para a obtenção da variação da rigidez estrutural e da densidade mineral óssea, propõe-se um modelo numérico mecanobiológico composto por cinco submodelos: da dinâmica da população de células ósseas, da resposta das células ao estímulo mecânico, da porosidade óssea, da densidade mineral óssea e, baseado na Lei de Voigt para materiais compósitos, da rigidez estrutural. Os valores das constantes das equações dos submodelos foram obtidos de literatura. Para a solução das equações do modelo, propõe-se uma implementação numérica e computacional escrita em linguagem C. O método de Runge-Kutta-Dorman-Prince, cuja vantagem consiste no uso de um passo de solução variável, é utilizado no modelo para controlar o erro numérico do resultado do sistema de equações diferenciais. Foi realizada uma avaliação comparativa entre os resultados obtidos com o modelo proposto e os da literatura dos modelos de remodelagem óssea recentes. Conclui-se que o modelo e a implementação propostos são capazes de obter variações da matriz de rigidez estrutural macroscópica e da densidade mineral óssea decorrentes da perturbação nos parâmetros mecânicos ou biológicos do processo de remodelagem óssea.

Determinação de biomarcadores de aflatoxina B1 e aplicabilidade na avaliação da eficiência de adsorventes em frangos de corte

As aflatoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos toxigênicos das espécies Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nomius. São amplamente encontradas em matérias-primas de rações animais, em especial o milho, e têm a capacidade de levar a quadros clínicos agudos ou crônicos de aflatoxicose, caracterizados por, desde a morte por hepatite aguda até a diminuição do desempenho zootécnico por diminuição de peso ou consumo de ração. A aflatoxina B1 tem sido considerada o metabólito mais perigoso, uma vez que possui alto poder hepatotóxico, além de ser mutagênica e carcinogênica. Atualmente a ciência trabalha rumo à descoberta de substâncias que sejam indicadoras confiáveis de contaminação por componentes tóxicos em homens e em animais, os chamados biomarcadores, que medem uma mudança celular, biológica ou molecular em um meio biológico (tecidos humanos, células ou fluídos) que fornecem informação a respeito de uma doença ou exposição a uma determinada substância. Sua detecção pode auxiliar na identificação, no diagnóstico e no tratamento de indivíduos afetados que podem estar sob risco, mas ainda não exibem os sintomas. Sendo assim, com o auxílio de análises que confirmem a patogenicidade da aflatoxina B1 (determinação da atividade de enzimas hepáticas, da avaliação da função renal, de hematologia, da dosagem de minerais séricos e da avaliação de desempenho zootécnico), o objetivo deste trabalho foi avaliar a aplicabilidade da determinação de resíduos hepáticos de aflatoxinas e do aduto sérico AFB1-lisina na avaliação da eficiência de adsorventes em frangos de corte. Utilizou-se 240 pintos de 1 dia, machos, de linhagem Cobb 500®, distribuídos aleatoriamente em 4 dietas experimentais: Controle Negativo: Ração Basal (RB); RB + 0,5% de adsorvente ((aluminosilicato de cálcio e sódio hidratado/HSCAS); RB + 0,5% de adsorvente + 500 µg de AFB1/kg de ração e; RB + 500 µg de AFB1/kg de ração.Os resultados experimentais mostram que o efeito deletério da AFB1, na concentração utilizada, é mais pronunciado que os efeitos protetores do HSCAS sobre os parâmetros de saúde dos animais. Não houve ação efetiva do adsorvente utilizado sobre quase nenhuma variável estudada, apenas para a redução das lesões histopatológicas em fígado, na redução da concentração de gama-glutamiltransferase (GGT), fósforo e aumento da contagem de hemáceas aos 21 dias de idade. Porém, influenciou positivamente a redução de resíduos hepáticos de aflatoxina G1 aos 21 dias e as concentrações de AFB1-lisina sérica aos 21 e aos 42 dias de idade. Estes dados são importantes porque permite concluir que, embora sintomatologicamente o HSCAS não tenha exercido função efetiva, molecularmente foi capaz de mostrar de eficácia sobre os alguns biomarcadores de aflatoxinas no organismo das aves

Efeito da substituição de plasma sanguíneo por levedura hidrolisada sobre rendimento e imunidade de leitões desmamados

O Experimento foi realizado com o objetivo de avaliar a substituição parcial e total de plasma bovino por levedura hidrolisada na dieta de leitões desmamados no período de 21 a 47 dias de idade. Foram utilizados 1600 leitões da linhagem PIC, distribuídos em blocos ao acaso, com quatro tratamentos. As dietas foram divididas em quatro fases (pré-inicial I 22 a 28 dias; pré-inicial II 29 a 35 dias; inicial I - 36 a 47 dias e inicial II 48 a 63 dias). A inclusão percentual, Plasma: Levedura, nas dietas foi: T1 (6:0; 4:0; 2:0 e 0:0); T2 (3: 4; 2: 3; 1: 2 e 0: 0); T3 (1,5: 6; 1: 4,5; 0,5: 3 e 0: 0) e T4 (0: 8; 0: 6; 0: 4 e 0: 0). Cada tratamento teve 10 repetições (cinco de machos e cinco de fêmeas) totalizando 40 unidades experimentais com 40 animais cada. As variáveis zootécnicas avaliadas durante o período experimental foram: consumo de ração, ganho de peso, e conversão alimentar. Foram tomadas amostras de sangue de 5 animais por tratamento no dia de início do experimento, e de 10 animais por tratamento 25 dias depois. Foram quantificadas a IgA e a IgG. Os dados obtidos foram submetidos a análise de variância ANOVA, utilizando-se o teste Tukey para comparação das médias ao nível de significância de 5% utilizando o pacote estatístico SAS. Não houve diferença estatística nas quantidades de Ig A e Ig G circulante, nem na variação destas imunoglobulinas no tempo, entre os tratamentos. Considerando a análise dos dados conclui-se que nas condições estudadas, a utilização da relação percentual de (1,5: 6; 1: 4,5; 0,5: 3 e 0: 0) de plasma: levedura hidrolisada resultou um maior consumo de ração e ganho de peso dos animais, em comparação às outras proporções, e consequentemente podendo trazer um maior lucro para o produtor

Contribuição das células-tronco mesenquimais para as propriedades tumorigênicas de células de glioblastoma humano

Células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam tropismo a tumores, sendo importantes componentes do estroma tumoral. No cérebro, o nicho perivascular é uma importante fonte de CTM, as quais podem contribuir direta e/ou indiretamente para o desenvolvimento de tumores, embora os mecanismos envolvidos sejam pouco conhecidos. No presente trabalho, investigou-se a influência de CTM sobre a proliferação, capacidade invasiva e tumorigenicidade de células de Glioblastoma (GBM) humano. Sabe-se que CTM produzem TGFB1, uma citocina multifuncional envolvida em imunomodulação, proliferação, migração e transição epitelial-mesenquimal de células tumorais. Experimentos in vitro, realizados com meios condicionados de CTM de cordão umbilical humano com silenciamento permanente do gene TGFB1, demonstraram que o TGFB1 secretado por CTM é capaz de aumentar significativamente a proliferação e viabilidade de células de GBM humano da linhagem U87FP635. Esses resultados revelam uma importante ação parácrina dessa citocina regulatória, quando produzida por outros tipos celulares contidos no microambiente tumoral. Entretanto, sob condições experimentais que melhor mimetizam o microambiente tumoral, detectou-se que CTM também afetam o comportamento de células tumorais por um mecanismo alternativo, dependente de contato celular, mas independente dos níveis de TGFB1 secretados pelas CTM. Sob condições de cocultivo celular, envolvendo contato físico entre CTM e células de GBM U87FP635, detectou-se um aumento significativo na quantidade de células tumorais viáveis. Quando cultivadas na forma de esferoides tumorais, o contato com CTM aumentou a capacidade invasiva das células U87FP635. Finalmente, em modelo in vivo ectópico de GBM, células U87FP635 geraram tumores mais desenvolvidos quando coinjetadas com CTM. Esses efeitos pró-tumorigênicos foram observados tanto em contato com CTM controles, quanto com CTM contendo o gene TGFB1 permanentemente silenciado. Assim, esses achados indicam que CTM podem exercer efeitos pró-tumorigênicos por dois mecanismos alternativos e independentes: ação parácrina de TGFB1 secretado por CTM e ação mediada por contato célula-célula. Nas condições experimentais testadas, o mecanismo dependente de contato célula-célula demonstrou ser predominante. O estudo proteômico do secretoma dessas células identificou 126 proteínas diferencialmente expressas além de 10 proteínas exclusivamente detectadas em meios condicionados de cocultivos de CTM com células de GBM U87FP635. Cerca de 80% dessas proteínas exclusivamente secretadas pelo contato célula-célula são componentes de exossomos e estão envolvidas em proliferação celular e desenvolvimento tecidual. Esses resultados apontam uma interação dinâmica de comunicação entre CTM e células tumorais, e revelam algumas proteínas interessantes potencialmente envolvidas em uma ação pró-tumorigênica de CTM mediada por contato celular