Síntese de potencial inibidor de acetilcolinesterase para tratamento da Doença de Alzheimer

A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência, representando cerca de 80% dos casos. A DA é caracterizada por um processo de declínio progressivo e irreversível das funções cognitivas e da memória, que se estende para a desorganização do comportamento. Atualmente, 46,8 milhões de pessoas em todo o mundo foram diagnosticadas com demência. Embora vários fatores tenham sido implicados na DA, sua etiologia ainda não é completamente conhecida. Do ponto de vista neuropatológico, é observado no cérebro de indivíduos com DA atrofia cortical difusa, presença de grande número de placas senis, emaranhados neurofibrilares, processo inflamatório e perda neuronal. A progressão dos sintomas está associada a mudanças estruturais nas sinapses colinérgicas em certas regiões do cérebro, que consequentemente, apresentam neurotransmissão colinérgica reduzida. Os vários eventos patológicos interligados contribuem para o avanço da doença e direcionam diversas pesquisas na busca por tratamentos multialvos com base no processo multifatorial de DA. Assim o presente trabalho descreve a síntese de derivados híbridos dual binding site de donepezila-tacrina (fármacos inibidores de acetilcolinesterase), com potencial para agir em dois alvos terapêuticos pela (i) inibição da acetilcolinesterase em ambos os sítios ativo e periférico, como demonstrado pelos estudos de modelagem molecular, e (ii) na agregação do peptídeo A? neurotóxico induzido pela acetilcolinesterase, na tentativa de interromper a progressão da doença. A estratégia sintética envolveu a condensação da 5,6-dimetóxiindanona com a unidade 4-piperidinil carbaldeído, a qual forneceu o intermediário 5,6- dimetóxindan-1-ona-4-piperidinil-metileno-1-[(4-cloroquinolin-2-il)metil], seguido de redução da dupla ligação, gerada na reação de condensação anterior, e substituição do átomo de cloro-quinolina por amino para obtenção do produto final, ou manutenção da função olefina, seguido de substituição do átomo de cloro-quinolina por azido ou amino, gerando cinco híbridos estruturalmente correlacionados. Os híbridos foram testados em ensaio de inibição de acetilcolinesterase e butirilcolinesterase pelo método de Ellman, e o híbrido insaturado, contendo a função amino-quinolina foi o mais ativo da série com IC50 na faixa de nanomolar (0,014 ?M). Futuramente, os intermediários da reação e produto final serão submetidos ao ensaio de inibição da agregação do peptídeo A? neurotóxico pelo método da tioflavina T. Neste trabalho, também são descritos os testes de predição in vitro para permeação pela barreira hematoencefálica, bem como sua absorção intestinal, pelo método PAMPA.

Efeito do inibidor de proteinase de origem vegetal EcTI, sobre a inflamação pulmonar alérgica crônica em camundongos Balb/c

INTRODUÇÃO: A prevalência de asma tem crescido e a maioria dos pacientes com asma grave não obtém o controle total dos sintomas com as terapias disponíveis, fazendo-se necessária a busca por novas alternativas terapêuticas. Inibidores de proteinases têm sido estudados como tratamento de processos inflamatórios, dentre eles o Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) OBJETIVO: Avaliar se o inibidor de proteinase EcTI modula a hiperresponsividade brônquica à metacolina, inflamação, remodelamento e estresse oxidativo nas vias aéreas e septos alveolares em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Vinte e quatro camundongos Balb/c machos, entre seis e sete semanas de vida, pesando em media 25 g foram divididos em quatro grupos: C (controle), OVA (sensibilizados com ovalbumina, 50 ug intraperironeal (i.p) nos dias 0 e 14 e desafiados nos dias 22, 24, 26, 28); C+EC (controle tratados com EcTI (2 mg/kg/i.p) nos dias 22 a 28); OVA+EC (sensibilizados e desafiados com ovalbumina e também tratados com EcTI (2 mg/kg -i.p) nos dias 22 a 28). No dia 29, foram realizadas realizadas: (i) hiperresponsividade à metacolina e obtidas as respostas máximas de resistência e elastância do sistema respiratório; (ii) análise histopatológica do pulmão para quantificação de eosinófilos, fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas (VA) e nos septos alveolares (SA); e (iii) imunohistoquímica para quantificação de células positivas para IFN-y, IL-4, IL-5, IL-13, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, iNOS, NF-kB e fração de volume de isoprostano nas VA e nos SA. Uma semana após o dia 29 foi realizada a técnica de anafilaxia cutanea passiva(PCA) para quantificar IgE e IgG1. A significância foi considerada quando p < 0,05. RESULTADOS: Houve aumento de todos os parâmetros avaliados no grupo OVA em relação ao grupo controle (p < 0,05). Houve atenuação da resposta máxima de Rrs e Ers no grupo OVA+EC comparado as grupo OVA (p < 0,05). O tratamento com EcTI nos animais sensibilizados atenuou o número de eosinófilos, células positivas para IL-4, IL-5, IL-13,IFN-y, iNOS, MMP-9, TIMP-1, NF-kB e TGF-beta e fração de volume de isoprostano, fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas e nos séptos alveolares quando comparado ao grupo OVA (p < 0,05).Houve reaçao de PCA nos animais sensibilizados com ovalbumina. CONCLUSÃO: EcTI atenuou a hiperresponsividade brônquica, a inflamação, o remodelamento e o estresse oxidativo nesse modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. Embora sejam necessários mais estudos, esse inibidor pode ser considerado uma futura ferramenta farmacológica para o tratamento de asma

Avaliação do tratamento com um inibidor para serinoprotease em modelo experimental de enfisema induzido por exposição à fumaça de cigarro

Introdução: Demonstramos previamente que em modelo experimental de enfisema pulmonar induzido por instilação de elastase, o inibidor de serinoprotease rBmTI-A promoveu a melhora da destruição tecidual em camundongos. Considerando que o tabagismo é o principal fator de risco para o desenvolvimento da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e que o modelo de exposição à fumaça de cigarro é considerado o que melhor mimetiza esta doença em humanos, este estudo teve por objetivo verificar a ação do inibidor para serinoproteases rBmTI-A sobre os processos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento do enfisema pulmonar, em modelo de exposição ao tabaco. Métodos: Para a indução do enfisema pulmonar, os animais foram expostos à fumaça de cigarro (duas vezes ao dia/ 30 minutos/ 5 dias por semana/ durante 12 semanas), e os animais controle permaneceram expostos ao ar ambiente. Dois protocolos de tratamento com o inibidor rBmTI-A foram realizados. No primeiro, os animais receberam duas administrações do inibidor rBmTI-A ou de seu veículo (Solução Salina 0,9%) por via intranasal, sendo a primeira após 24h do término das exposições ao cigarro e outra, 7 dias após à primeira instilação do inibidor. No segundo protocolo, os animais receberam 3 administrações do inibidor rBmTI-A, durante o tempo de exposição (1ª dose: 24h antes do início da exposição à fumaça de cigarro; 2ª dose: um mês após o início da exposição; 3ª dose: dois meses após o início). Após o término dos protocolos de exposição e tratamento, os animais foram submetidos aos procedimentos para coleta dos dados de mecânica respiratória e avaliação do Intercepto Linear Médio (Lm). Para o segundo protocolo, realizamos também as medidas para quantificação de fibras de colágeno e elástica, da densidade de células positivas para MAC-2, MMP-12 e 9, TIMP-1, Gp91phox e TNFalfa; no parênquima através de imunohistoquímica, contagem de células polimorfonucleares além da expressão gênica de MMP-12 e 9 no pulmão através de RT-qPCR. Resultados e Discussão: O tratamento com o inibidor para serinoprotease rBmTI-A atenuou o desenvolvimento do enfisema pulmonar apenas no segundo protocolo, quando foi administrado durante a exposição à fumaça de cigarro. Embora os grupos Fumo-rBmTIA e Fumo-VE apresentem aumento de Lm comparados aos grupos controles, houve uma redução deste índice no grupo Fumo-rBmTIA comparado ao grupo Fumo-VE. O mesmo comportamento foi observado para as análises de proporção em volume de fibras de elástica e colágeno no parênquima. Além disto, observamos aumento de macrófagos, MMP-12, MMP-9 e TNFalfa; nos grupos expostos à fumaça de cigarro, mas o tratamento com o inibidor rBmTI-A diminuiu apenas a quantidade de células positivas para MMP-12. Na avaliação da expressão gênica para MMP-12 e 9, não observamos diferença entre os grupos experimentais e o mesmo comportamento foi observado para a quantidade de células polimorfonucleares no parênquima. Além disso, observamos aumento de GP91phox e TIMP-1 nos grupos tratados com rBmTIA. Conclusões: Tais resultados sugerem que o inibidor rBmTI-A não foi efetivo como tratamento da lesão após a doença instalada. Entretanto, atenuou o desenvolvimento da doença quando administrado durante a indução do enfisema, possivelmente através do aumento de GP91phox e TIMP-1, acompanhados pela diminuição de MMP-12.

Estresse oxidativo em porfiria hepática experimental disparada por succinilacetona - um inibidor da ácido 5-aminolevulínico desidratase

Para otimizar um modelo experimental para o estudo do desbalanço redox em porfirias relacionadas ao acúmulo de ácido 5-aminolevulínico-(ALA), via inibição da ALA desidratase-(ALA-D), ratos foram tratados com o éster metílico de succinilacetona-(SAME), um catabólito da tirosina que inibe fortemente a ALA-O, mimetízando o estado metabólico observado nos portadores de portirias e tirosinemias. Estabeleceram-se modelos de tratamento agudo por 36 e 18 h. No primeiro, os animais receberam 3 injeções de SAME (10, 40 ou 80 mg/kg, grupos Ali-IV). No segundo, os animais receberam 3 injeções de 40 mg/kg de SAME, ALA ou éster metílico de ALA (grupos BII-IV), ALA:SAME (30: 10 mg/kg, grupo BV), ou 10 mg/kg SAME (grupo BVI). Paralelamente, avaliou-se se os sintomas neurológicos característicos das portirias decorriam de danos oxidativos mitocondriais. Para isso, aplicou-se uma tecnologia óptica para medidas da difusão da depressão cortical que determinou a oxigenação e o estado redox do cit c em mitocôndrias do córtex cerebral de ratos submetidos ao tratamento crônico com ALA (40 mg/kg), SAME (10 e 40 mg/kg) e ALA:SAME (30: 1O mg/kg), a cada 48 h, durante 30 dias. Tratamento agudo/36 h: Os níveis de ALA no plasma, fígado, cérebro e urina e o clearance renal do ALA aumentaram nos grupos tratados. A atividade de ALA-D e a coproporfirina urinária reduziram. A marcação para proteínas carboniladas, ferro e ferritina aumentou no fígado e cérebro dos grupos tratados, especialmente no All. Os níveis de malondialdeído hepático aumentaram no grupo AIV. A razão GSH/GSH+GSSG e a atividade de GPx cerebrais aumentaram nos grupos AIV e AIII, respectivamente. Consistentemente com estes dados indicando um desbalanço oxidativo induzido pelo SAME, alterações mitocondriais e citosólicas ultraestruturais foram reveladas, especialmente no fígado. Tratamento agudo/18 h: Os níveis de ALA plasmáticos aumentaram nos grupos tratados, exceto em BIV. O grupo BII mostrou aumento dos níveis hepáticos de ALA. Interessantemente, a inibição da atividade de ALA-D não foi evidenciada. O conteúdo de ferro plasmático aumentou no grupo BII. Para os grupos tratados com 10 e 40 mg SAME/kg, a atividade de SOD hepática reduziu ~50% com a extensão do tratamento de 18 para 36 h, sugerindo que este último é mais efetivo em promover danos oxidativos induzidos pelo ALA. Tratamento crônico/30 dias: Embora nenhuma alteração tenha sido evidenciada no estado redox dos animais tratados, o tratamento com ALA reduziu o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) e o consumo de oxigênio-(CMRO2), sugerindo uma vasoconstrição mediada pelo ALA, efeito este confirmado por ensaios de reatividade vascular conduzidos em anéis de aorta de ratos incubados com ALA. O tratamento com ALA:SAME restaurou os níveis de CBF e CMRO2. Interessantemente, a disponibilidade do radical superóxido-(O2•-) estava reduzida nos anéis de aorta incubados com ALA. Juntos, estes dados: a)validam o modelo de tratamento agudo/36 h para o estudo bioquímico e dos possíveis efeitos fisiológicos induzidos pelo ALA, e b)sugerem que as alterações mediadas pelo ALA exógeno levam à vasoconstrição.