Estudo da cinética da tirosinase imobilizada em nanopartícula de sílica com obtenção de revestimento de eumelanina

Melanina é um polímero constituído por uma grande heterogeneidade de monômeros tendo como característica comum a presença de grupos indóis. Por outro lado, a eumelanina produzida pela oxidação enzimática da tirosina é um polímero mais simples constituído principalmente de monômeros 5,6-dihidroxindol (DHI) e de indol-5,6-quinona (IQ). Tirosinase é a enzima chave na produção de melanina, sendo que a sua atividade cinética é medida em função da formação do intermediário dopacroma. Nanopartículas (NPs) de sílica são partículas nanométricas compostas de oxido de silício e são obtidas pelo processo sol-gel desenvolvido por Stöber de hidrólise e condensação de tetraetilortosilicato (TEOS), usando etanol como solvente em meio alcalino. As NPs foram funcionalizadas com 3-Aminopropiltrietoxissilano (ATPES) e depois com glutaraldeído. Este último permitiu a imobilização da tirosinase na superfície da sílica. Caracterizamos as NPs antes e após a reação da enzima, a atividade catalítica da enzima ligada à NP e o mecanismos de formação de melanina na superfície da sílica. As NPs foram caracterizadas por espectrofotometria de absorção e de reflectância, termogravimetria e microscopia eletrônica. A síntese da NP de sílica retornou partículas esféricas com 55nm de diâmetro e a funcionalização da partícula mostrou modificar eficientemente a sua superfície. A imobilização da tirosinase por ligação covalente foi de 99,5% contra 0,5% da adsorção física. A atividade da tirosinase foi caracterizada pela formação de dopacroma. O Km da enzima imobilizada não sofreu alteração em comparação com a tirosinase livre, mas a eficiência catalítica - que considera a eficiência recuperada - foi de apenas 1/3 para a enzima ligada covalentemente, significando que 2/3 das enzimas ligadas não estão ativas. Obtivemos NPs revestidas com melanina a partir de oxidação de tirosina solubilizada em duas preparações: NP com tirosinase ligada covalentemente na superfície e NP funcionalizada com glutaraldeido dispersa em solução de DHI e IQ. O revestimento de melanina foi na forma de um filme fino com espessura ~1,9nm, conferindo perfil de absorção luminosa equivalente ao da própria melanina. Mostramos que o mecanismo de polimerização passa pela oxidação da tirosina pela tirosinase, que gera intermediários oxidados (principalmente DHI e IQ) que vão para solução (mesmo quando a tirosinase está ligada covalentemente na sílica). Estes intermediários ligam-se ao glutaraldeido e a superfície da sílica passa a funcionar como ambiente de polimerização da melanina.

Imobilização do fungo Penicillium citrinum CBMAI 1186 e lipase de Pseudomonas fluorescens em biopolímeros para aplicações em biocatálise

Diversos biomateriais podem ser aplicados como suportes na imobilização de células totais de fungos filamentosos ou enzimas isoladas, visando a manutenção e o prolongamento da atividade enzimática em processos biocatalíticos. Exemplos promissores de biomateriais são a fibroína da seda e o alginato de sódio. A fibroína é um material protéico com alta estabilidade térmica, elasticidade, resistência à tensão, não sofre ataque microbiano, baixo custo de purificação e alta tenacidade, o alginato é um biopolímero versátil, devido a suas propriedades gelificantes em soluções aquosas. Assim, neste trabalho empregou-se micélios do fungo derivado de ambiente marinho, Penicillium citrinum CBMAI 1186, livres e imobilizados em biopolímeros (fibra de algodão, fibra de fibroína da seda e fibra de paina) na biorredução quimiosseletiva, regiosseletiva e enantiosseletiva da ligação α,β-C=C de enonas α,β-, α,β,γ,δ- e di-α,β-insaturadas previamente sintetizados pela a reação de condensação aldólica. Foi possível a utilização do fungo P. citrinum CBMAI 1186 na redução quimiosseletiva, regiosseletiva e enantiosseletiva da ligação dupla carbono-carbono de sistemas α,β-insaturados. A imobilização do fungo P. citrinum CBMAI 1186 em biopolímeros (algodão, fibroína da seda, paina e quitosana) permitiu a prolongamento da atividade celular do fungo. O protocolo desenvolvido foi capaz de obter compostos até então descritos apenas por síntese clássica. Também foi realizado reações de resolução enzimática de derivados de haloidrinas por diferentes lipases microbianas de: Pseudomonas fluorescens, Candida cylindracea, Rhizopus niveus e Aspergillus niger. A lipase de P. fluorescens foi imobilizada em esferas de fibroína do bicho da seda (método 1, via adsorção) e em blenda com alginato de cálcio (método 2, via encapsulação) em diferentes condições, tais como, variação de solvente, variação da quantidade de enzima imobilizada e tempo de reação. As condições otimizadas foram empregadas em diferentes haloidrinas, rendendo elevados excessos enantioméricos (ee > 99%) e alta razão enanantiomérica (E > 200) para os produtos acetilados. Foi possível desenvolver um protocolo simples, barato e prático para a síntese enantiosseletiva de haloidrina reforçando a versatilidade da fibroína e do alginato como suportes de imobilização para catalisadores heterogêneos. Também foi possível utilizar a lipase imobilizada (método 2) na reação de transesterificação para obtenção do biodiesel etílico. As melhores condições para o bom funcionamento do biocatalisador foram: 30% do biocatalisador, 20% de n-hexano, relação óleo e etanol de 1:4 a 32 ºC por 48 h em agitação magnética (400 rpm). Essas condições permitiram a formação de 42% de rendimento do biodiesel etílico. O biocatalisador apresentou algumas limitações reacionais, tais como, fragilidade frente a elevadas temperaturas (> 32 ºC) e prolongado tempo de agitação magnética. Porém, permaneceu apto no meio por 4 ciclos consecutivas. Conclui-se que os biomateriais (fibroína, alginato e quitosana) podem ser utilizados como alternativas versáteis na imobilização de micélios de fungos filamentoso e de enzimas isoladas para aplicações em biocatalíticas.