Participação do nicho endosteal na regulação da hemopoese de camundongos submetidos à desnutrição proteica

O nicho endosteal da medula óssea abriga as células-tronco hemopoéticas (CTH) em quiescência/autorrenovação. As CTH podem ser classificadas em dois grupos: células que reconstituem a hemopoese em longo prazo (LT-CTH) e curto prazo (CT-CTH). Investigamos, neste trabalho, os efeitos da desnutrição proteica (DP) no tecido ósseo e a participação do nicho endosteal na sinalização osteoblasto-CTH. Para tanto, utilizamos camundongos submetidos à DP induzida pelo consumo de ração hipoproteica. Os animais desnutridos apresentaram pancitopenia e diminuição nas concentrações de proteínas séricas e albumina. Quantificamos as CTH por citometria de fluxo e verificamos que os desnutridos apresentaram menor porcentagem de LT-CTH, CT-CTH e de progenitores multipotentes (PMP). Avaliamos a expressão das proteínas CD44, CXCR4, Tie-2 e Notch-1 nas LT-CTH. Observamos diminuição da expressão da proteína CD44 nos desnutridos. Isolamos as células LT-CTH por cell sorting e avaliamos a expressão gênica de CD44, CXCR4 e NOTCH-1. Verificamos que os desnutridos apresentaram menor expressão de CD44. Em relação ao ciclo celular, verificamos maior quantidade de LT-CTH nas fases G0/G1. Caracterizamos as alterações do tecido ósseo femoral, in vivo. Observamos diminuição da densidade mineral óssea e da densidade medular nos desnutridos. A desnutrição acarretou diminuição da área média das seções transversais, do perímetro do periósteo e do endósteo na cortical do fêmur dos animais. E na região trabecular, verificou-se diminuição da razão entre volume ósseo e volume da amostra e do número de trabéculas, aumento da distância entre as trabéculas e prevalência de trabéculas ósseas em formato cilíndrico. Avaliamos a expressão de colágeno, osteonectina (ON) e osteocalcina (OC) por imuno-histoquímica, e de osteopontina (OPN) por imunofluorescência no fêmur e verificamos diminuição da marcação para OPN, colágeno tipo I, OC e ON nos desnutridos. Evidenciamos, pela técnica do Picrosírius, desorganização na distribuição das fibras colágenas e presença de fibras tipo III nos fêmures dos desnutridos, além de maior número de osteoclastos evidenciados pela reação da fosfatase ácida tartarato resistente. Os osteoblastos da região femoral foram isolados por depleção imunomagnética, imunofenotipados por citometria de fluxo e cultivados em meio de indução osteogênica. Observamos menor positividade para fosfatase alcalina e vermelho de alizarina nas culturas dos osteoblastos dos desnutridos. Avaliamos, por Western Blotting, a expressão de colágeno tipo I, OPN, osterix, Runx2, RANKL e osteoprotegerina (OPG), e, por PCR em tempo real, a expressão de COL1A2, SP7, CXCL12, ANGPT1, SPP1, JAG2 e CDH2 nos osteoblastos isolados. Verificamos que a desnutrição acarretou diminuição da expressão proteica de osterix e OPG e menor expressão gênica de ANGPT1. Avaliamos a proliferação das células LSK (Lin-Sca1+c-Kit+) utilizando ensaio de CFSE (carboxifluoresceína succinimidil ester). Foi realizada cocultura de células LSK e osteoblastos (MC3T3-E1) na presença e ausência de anti-CD44. Após uma semana, verificamos menor proliferação das LSK dos desnutridos. O bloqueio de CD44 das LSK do grupo controle diminuiu a proliferação destas em três gerações. Entretanto, nos desnutridos, esse bloqueio não afetou a proliferação. Concluímos que a DP promoveu alterações no tecido ósseo e nas CTH. Entretanto, não podemos afirmar que as alterações observadas no sistema hemopoético foram decorrentes de alterações exclusivas do nicho endosteal.

Genetic diversity and susceptibility to Vip3Aa20 protein in Brazilian populations of Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae)

Helicoverpa armigera (Hübner) was officially reported in Brazil in 2013. This species is closely related to Helicoverpa zea (Boddie) and has caused significant crop damage in Brazil. The use of genetically modified crops expressing insecticidal protein from Bacillus thuringiensis (Berliner) has been one of the control tactics for managing these pests. Genetically modified maize expressing Vip3Aa20 was approved to commercial use in Brazil in 2009. Understanding the genetic diversity and the susceptibility to B. thuringiensis proteins in H. armigera and H. zea populations in Brazil are crucial for establishing Insect Resistance Management (IRM) programs in Brazil. Therefore, the objectives of this study were: (a) to infer demographic parameters and genetic structure of H. armigera and H. zea Brazil; (b) to assess the intra and interspecific gene flow and genetic diversity of H. armigera and H. zea; and (c) to evaluate the susceptibility to Vip3Aa20 protein in H. armigera and H. zea populations of Brazil. A phylogeographic analysis of field H. armigera and H. zea populations was performed using a partial sequence data from the cytochrome c oxidase I (COI) gene. H. armigera individuals were most prevalent on dicotyledonous hosts and H. zea individuals were most prevalent on maize crops. Both species showed signs of demographic expansion and no genetic structure. High genetic diversity and wide distribution were observed for H. armigera. A joint analysis indicated the presence of Chinese, Indian, and European lineages within the Brazilian populations of H. armigera. In the cross-species amplification study, seven microsatellite loci were amplified; and showed a potential hybrid offspring in natural conditions. Interespecific analyses using the same microsatellite loci with Brazilian H. armigera and H. zea in compare to the USA H. zea were also conducted. When analyses were performed within each species, 10 microsatellites were used for H. armigera, and eight for H. zea. We detected high intraspecific gene flow in populations of H. armigera and H. zea from Brazil and H. zea from the USA. Genetic diversity was similar for both species. However, H. armigera was more similar to H. zea from Brazil than H. zea from the USA and some putative hybrid individuals were found in Brazilian populations.Tthere was low gene flow between Brazilian and USA H. zea. The baseline susceptibility to Vip3Aa20 resulted in low interpopulation variation for H. zea (3-fold) and for H. armigera (5-fold), based on LC50. H. armigera was more tolerant to Vip3Aa20 than H. zea (≈ 40 to 75-fold, based on CL50). The diagnostic concentration for susceptibility monitoring, based on CL99, was fairly high (6,400 ng Vip3Aa20/cm2) for H. zea and not validated for H. armigera due to the high amount of protein needed for bioassays. Implementing IRM strategies to Vip3Aa20 in H. armigera and H. zea will be of a great challenge in Brazil, mainly due to the low susceptibility to Vip3Aa20 and high genetic diversity and gene flow in both species, besides a potential of hybrid individuals between H. armigera and H. zea under field conditions.